[發(fā)明專利]冬蟲夏草中國被毛孢磷脂酶C、編號基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410305839.6
• 申請日: 2014-06-30
• 公開（公告）號: CN104120115B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 柳志強;鄭裕國;林善;薛亞平;吳暉;李邦良;許靜;許峰;袁水金;王鴻艷
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學;杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12P13/00;C12P7/64;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一個來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與水解磷脂制備相應(yīng)游離脂肪酸中的磷脂酶C(Laccase)，編碼這個酶的基因及其應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥。現(xiàn)代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

但是，對冬蟲夏草中國被毛孢中磷脂酶C的研究幾乎為空白，尤其在參與中國被毛孢水解磷脂制備相應(yīng)游離脂肪酸中的磷脂酶C的研究上。

磷脂酶是在生物體內(nèi)存在的可以水解甘油磷脂的一類酶,其中主要包括磷脂酶A1、AC、B、C和D，它們特異地作用于磷脂分子內(nèi)部的各個酯鍵，形成不同的產(chǎn)物，被廣泛用于甘油磷脂的改造。磷脂酶C(EC:3.1.4.3)可以催化PIP2分解產(chǎn)生1,4,5-肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)兩個第二信號分子，是存在于胞漿膜上的一個關(guān)鍵酶。

2001年，查纻光等人從廣西產(chǎn)金環(huán)蛇(Bungarus fasciatus)毒腺中抽提總RNA，經(jīng)mRNA純化后構(gòu)建了金環(huán)蛇毒腺cDNA文庫。根據(jù)已發(fā)表的眼蛇科蛇毒磷脂酶A[2]基因序列中的保守區(qū)設(shè)計探針篩選克隆，得到2個磷脂酶A[2]基因。測定兩者序列，其cDNA的閱讀框均為435bp，編碼145個氨基酸的磷脂酶A[2]前體。

2002年，李偉琳用探針從紫紅鏈霉菌2917基因組文庫中克隆出磷脂酶A3基因，經(jīng)雙向測序，確定了其基因的全序列，并由此推導出其氮基酸序列，將此序列與其他來源的磷脂酶A2基因序列進行了比較研究，結(jié)果顯示，與天藍色鏈霉菌A3(2)中磷脂酶A2的同源性為98％，與蛇毒的磷脂酶A2的同源性小于10％。

2007年，盧冬梅等人從超嗜熱需氧古細菌Aeropyrum pernix K1中抽提出染色體基因組，經(jīng)PCR擴增得到磷脂酶A2基因，用帶有His-tag標記的pET15b作為表達載體，在大腸桿菌BLP中成功地誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)過Ni.螯合柱一步得到純化。SDS-PAGE檢測只有一條帶，其準確分子量為17.871kD。

2007年，羅滟蘇等人應(yīng)用銜接頭PCR技術(shù)，以藍豬耳(Torenia fournieri)全基因組DNA分別經(jīng)DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后與銜接頭連接產(chǎn)物為模板，用銜接頭引物和TfPLC1基因的特異引物經(jīng)過多輪的巢式PCR，先后克隆到2個798和813bp的TfPLC1基因上游序列，經(jīng)測序、blast比較分析和拼接得到一個藍豬耳TfPLC1基因的啟動子序列，共1432bp。

2010年，徐賢廣等人研究牛分枝桿菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病機理中的作用，本研究構(gòu)建了表達M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重組質(zhì)粒pET30a-LIP，經(jīng)IPTG誘導在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達，SDS-PAGE分析表明，重組蛋白表達量占菌體總蛋白的20％，該蛋白經(jīng)電洗脫純化后，純度達95％以上。

2011年，JS Seo等人從牙鲆的cDNA上通過cDNA末端(RACE)快速擴增克隆到了一個磷脂酶C基因。該cDNA編碼含有一個高度保守的PH結(jié)構(gòu)域，催化X和Y結(jié)構(gòu)域，C2結(jié)構(gòu)域1244個氨基酸長度的多肽。