[發明專利]一種用于評價三七抗凝活性的生物效價檢定方法

在審

• 申請號: 201410301969.2
• 申請日: 2014-06-27
• 公開（公告）號: CN105277666A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 王伽伯;肖小河;王艷輝;張雅銘
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15;G01N1/28
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 蘇蕾;高瑜

1.一種用于評價三七抗凝活性的生物效價檢定方法，所述生物效價檢定方法包括以下步驟：

a.配制供試品溶液和供試品稀釋液

制備三七藥材的干浸膏；

在測定前，用生理鹽水將所述干浸膏配置成供試品溶液，過濾除菌，貯存，優選地在4℃下進行貯存，備用；

測定時，估計供試品抗凝效價，用所述生理鹽水稀釋所述供試品溶液，得到不同濃度的供試品稀釋液；

b.配制對照品溶液和對照品稀釋液

用所述生理鹽水將阿司匹林配制成對照品溶液，過濾除菌，貯存，優選地在4℃下進行貯存，備用；

測定時，用所述生理鹽水稀釋所述對照品溶液，得到不同濃度的對照品稀釋液；

c.測試

取凝血儀測試杯，向每個通道加入血漿并加入供試品稀釋液或對照品稀釋液，充分混勻，預溫后，用全自動凝血儀進行檢測；

d.生物效價計算

以所述全自動血凝儀所檢測的凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間及纖維蛋白原為評價指標且對給藥濃度取對數，優選地，以活化部分凝血活酶時間為評價指標，按照2010年版《中國藥典》生物檢定統計法項下的量反應平行線法(2·2)計算三七藥材樣品的抗凝效價及實驗誤差，可信限率FL％不得超過40％，優選地不超過30％。

2.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，所述干浸膏通過以下制備：

將三七藥材樣品粉碎成粗粉，置于圓底燒瓶中，加提取溶劑浸泡，回流提取，抽濾，減壓回收溶劑，真空干燥，得干浸膏并計算收率；

優選地，所加入的提取溶劑的以毫升計的體積為三七藥材樣品粗粉的以克計的重量的5-15倍；浸泡時間為30分鐘；回流提取兩次，每次1.5小時。

3.根據權利要求2所述的生物效價檢定方法，其中，所述提取溶劑是體積百分數為75％的乙醇、體積百分數為75％的甲醇或水，優選地，所述提取溶劑為水，更優選地，所述提取溶劑為去離子水。

4.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，在步驟a和步驟b中，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

5.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，所述供試品溶液的濃度為10mg·ml^-1，所述對照品溶液的濃度為5mg·mL^-1。

6.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，用于測試的血漿為大鼠血漿、家兔新鮮血漿、兔血凍干血漿或健康人凍干血漿，優選地，所述血漿為家兔新鮮血漿。

7.根據權利要求6所述的生物效價檢定方法，其中，所述家兔新鮮血漿通過以下制備：

取家兔4只，禁食12小時，用一次性采血針自家兔耳緣靜脈取血，迅速注入一次性枸櫞酸鈉抗凝管中，充分混勻，3000r/min離心15min，分離血漿并置于冰浴中備用。

8.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，在步驟c中，加入到通道的血漿的體積為200μL；加入到通道的供試品稀釋液或對照品稀釋液的體積為200μL；預溫時間為100-200s。

9.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，所述供試品稀釋液的濃度為0.89～5.0mg·mL^-1，優選地，所述供試品稀釋液的濃度為1.33mg·mL^-1和1.77mg·mL^-1。

10.根據權利要求1所述的生物效價檢定方法，其中，所述對照品稀釋液的濃度為0.48～2mg·mL^-1，優選地，所述對照品稀釋液的濃度為0.75mg·mL^-1和1.00mg·mL^-1。