[發明專利]一種高質高效的多酚多糖類植物樣品RNA提取方法

有效

• 申請號: 201410298718.3
• 申請日: 2014-06-26
• 公開（公告）號: CN104017804B
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 李俊成;歐陽昆唏;黃浩;陳曉陽
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體地說，本發明涉及一種高效率高質量的植物RNA提取方法。

背景技術

提取高質量的，沒有多糖、多酚、基因組DNA、蛋白質或者其它次生代謝物質污染的RNA對于研究植物生長發育過程中基因的功能和表達方式等很多后續的實驗都至關重要，比如反轉錄PCR，實時定量PCR，cDNA文庫構建，Northern印跡雜交和RNA-seq等。

酚類很容易被氧化成為醌類，而醌類會和蛋白質及核酸發生不可逆轉的結合。而多糖類物質可以和RNA共沉淀，降低RNA的純度，影響在下游實驗中的使用。

現在市場上常用的商業RNA提取試劑盒，比如Takara，Promega和Omega等對多酚多糖類植物RNA提取也有較強的局限性。使用CTAB法可以部分克服多糖多酚類物質的干擾，但是CTAB法費時費力，經常會造成RNA的降解。

以此，我們結合使用CTAB裂解液裂解和試劑盒吸附柱純化的方法，發明了一種高效的在多酚多糖植物樣品中提取高質量RNA的方法。

發明內容

本發明針對目前分子生物學研究中對高質量植物RNA的需求，開發了一種高效率高質量提取含多酚多糖類植物樣品RNA的方法。

本發明技術方案如下，主要特點是：

A裂解：液氮研磨后的樣品100mg加入經過60℃預熱的CTAB裂解液600μl，同時加入12μl的β-巰基乙醇，渦旋振蕩2min，60℃裂解10min，期間上下顛倒混勻數次，

B抽提：加入600μl按照24:1混勻的氯仿：異戊醇，渦旋震蕩2min離心10min吸取上清后再次用上述氯仿：異戊醇抽提離心10min(對于芽、嫩葉等色素或者其它代謝物質豐富的組織器官要適當增加離心時間，比如黃梁木(Neolamarckia cadamba)的芽離心20min效果最佳)。

所述裂解液的配制：2％CTAB,2％PVP K-40,100mM Tris-HCl(pH8.0),25mM EDTA(pH8.0),2.0M NaCl,2g/L亞精胺。

本發明的高效率高質量的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖類植物組織樣品的RNA，并且純度高，無降解，可以直接用于下游實驗。

附圖說明

圖1為使用該方法提取的常見多酚多糖類植物樣品的RNA電泳圖。

圖2為使用該方法提取的黃梁木各組織RNA電泳圖。

圖3為使用該方法提取的常見多酚多糖類植物樣品的RNA濃度及OD值。

圖4為使用該方法提取的黃梁木各組織RNA濃度及OD值。

具體實施方式

結合實施例對本發明進行詳細說明。

實施例一黃梁木葉片RNA的提取

采取一年生黃梁木(株高1.5m，地徑2.1cm)中上部成熟的葉片，迅速放入液氮速凍，研磨成微小的顆粒放入1.5ml無RNase污染的離心管中，每管樣品約100mg。

提前配制的CTAB裂解液經60℃預熱后，吸取600μl加入樣品中，同時加入10μl的β-巰基乙醇，渦旋振蕩兩分鐘后60℃恒溫裂解10min，期間顛倒混勻數次。

加入按24:1混勻的氯仿：異戊醇抽提液600ul，渦旋振蕩2min，4℃14，000x g離心10min。吸取上清液到一個新的離心管中再次加入600ul的抽提液渦旋振蕩2min，4℃14，000x g離心10min。

吸取上清到一個新的離心管中，加入500ul的Buffer RB，和500ul無水乙醇，顛倒混勻。

將上述溶液轉移到Hibind RNA Mini column上，常溫10,000x g離心1min，棄去濾液。

吸附柱上加入300ul RWC wash Buffer，常溫10,000x g離心1min，棄去濾液。

在吸附柱膜的中央滴入混合好的DNase Ⅰ消化液75ul(使用時現配，1.5ul RNase-free DNase Ⅰ和73.5ul OBI DNase Ⅰ Digestion Buffer)，室溫(25℃-30℃)孵育15min。

將吸附柱轉移至一個新的收集管中，加入400ul RWC wash Buffer，室溫放置5min，常溫10,000x g離心1min，棄去濾液。