[發明專利]一種去除胰蛋白酶中的內毒素的方法

在審

• 申請號: 201410294257.2
• 申請日: 2014-06-26
• 公開（公告）號: CN104017792A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 黃臻輝;周建華;周偉潔;琚姝;王克平;汪雅雯;孫源遠
• 申請（專利權）人: 上海第一生化藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 朱水平;王衛彬

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種去除胰蛋白酶中的內毒素的方法。

背景技術

胰蛋白酶是動物胰臟所分泌的一種重要的蛋白水解酶，能水解蛋白質和多肽，可以選擇性的水解精氨酸和賴氨酸的肽鏈，為一肽鏈內切酶，對各種炎癥、潰瘍、膿汁、血腫、膿胸、皮膚以及消化組織細胞等疾病具有間接和直接的治療作用。作為一種肌內注射藥品，為保障其臨床應用安全性，需對其內毒素含量進行控制。內毒素產生于革蘭氏陰性細菌的細胞外壁，其主要成份是脂多糖(LPS)及類脂A，是熱原的活性部分。它們的相對分子質量一般為1萬～2.5萬，在水溶液中形成締合體，相對分子質量可達50萬～100萬。其具有耐熱性和化學穩定性，不易被除滅。注入人體的注射劑中含有熱原量達1μg/kg就可引起不良反應，發熱反應通常在注入1小時后出現，可使人體產生發冷、寒顫、發熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40℃以上，嚴重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。因此，在生物制品生產過程中，需要有嚴格的工藝控制策略對內毒素進行去除或限量控制。

目前，水溶液中常用的內毒素去除方法主要有如下幾種：

1、超濾

內毒素具有較大的相對分子質量，因此，可選用超濾膜去除水中的內毒素。在使用超濾方法去除內毒素時需要根據被處理藥物的相對分子質量、特性選擇超濾膜的孔徑及材質，因此該方法不具備通用性。另外，內毒素并不以單一分子存在，而是以相對分子質量不等的集聚體存在，因此大小不一，這也給超濾法去除內毒素帶來了挑戰。

2、活性炭吸附法

活性炭吸附是一種較早用于內毒素去除的方法，但是，由于活性炭選擇性差，在吸附內毒素的同時吸附有效活性成分，影響產品收率。

3、化學降解法

化學降解法是指用強酸、強堿或氧化劑等使內毒素降解以達到去除內毒素的目的，這種方法有可能造成有效成分的降解或失活，因此，該方法的使用需結合產品的理化性質。

4、離子交換色譜法

離子交換色譜法是根據內毒素帶有部分負電荷的性質，用陰離子交換色譜來去除內毒素，但這種方法不適合于溶液中存在其它帶負電荷物質的情況。

蛋白質種類較多，其分離純化步驟各不相同，不同終產品對內毒素含量要求也有差異，因此，去除內毒素的方法和效果無法完全通用。胰蛋白酶作為一種活性蛋白酶類藥物，其具有易失活、不穩定的特點，在內毒素去除過程中保證其本身性質及有效活性成分不受影響至關重要，這也是本領域長期以來存在的、難以克服的技術難題。在胰蛋白酶內毒素去除方法選擇過程中，超濾法因胰蛋白酶分子量較大而無法應用，活性炭吸附法專一性不強，化學降解法極易造成胰蛋白酶失活，色譜法耗時較長，不利于胰蛋白酶穩定。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于為了克服現有技術中胰蛋白酶中的內毒素無法去除徹底、易造成胰蛋白酶失活、耗時較長的缺陷，而提供了一種去除胰蛋白酶中的內毒素的方法。本發明的方法將超濾與磷酸鈣沉淀聯合使用，可以有效除去內毒素，且不會影響胰蛋白酶的活性，適用于大規模條件下除去蛋白質中的內毒素。

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：

本發明提供了一種去除胰蛋白酶中的內毒素的方法，其包括下述步驟：將胰蛋白酶濾餅溶解于水中，超濾濃縮得到濃縮液，依次加入磷酸鹽水溶液和鈣鹽水溶液，調節pH值為8～9，離心，即可。

其中，所述的胰蛋白酶濾餅可為本領域常規的胰蛋白酶處理方法得到的胰蛋白酶濾餅，一般經過多步鹽析、結晶、過濾、活化、鹽析得到，較佳地通過下述步驟得到：將胰蛋白酶原料用水溶解，加入硫酸調節pH值為2～3，加入飽和硫酸銨溶液鹽析，加入硼酸緩沖液調節pH值為7.5～7.7，再加入胰蛋白酶進行活化，用硫酸調節pH值為2.5～3.5，加入固體硫酸銨進行鹽析，即得到胰蛋白酶濾餅。