[發明專利]一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法

在審

• 申請號: 201410292500.7
• 申請日: 2014-06-26
• 公開（公告）號: CN104046595A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發明（設計）人: 唐霜;張忠;夏菡;范兆軍;李天憲
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術領域

本發明涉及病毒的分離接種技術，特別涉及一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法。

背景技術

雞胚分離病毒是一種經典的病毒分離方法，來自禽類的病毒，均可在雞胚中繁殖，哺乳動物的病毒如藍舌病病毒、流感病毒等也可在雞胚中增殖，近期發現CCHFV病毒也可在雞胚中增殖。目前雞胚尤其是SPF雞胚被廣泛利用于分離病毒、制造疫苗和抗原等，其來源豐富，操作簡便。除病毒外，衣原體、立克次氏體也可用雞胚來培養。常用的雞胚接種的途徑一般分為3種：絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種。其中尿囊腔接種的方法適用于新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、腺病毒、禽流感病毒等病原的分離。近年來，H5N1、H1N1、H7N9等流感病毒肆虐，WHO歷年在應對全球性流感病毒防控時，都推薦使用接種雞胚尿囊腔的方法來進行流感病毒的分離。

傳統禽流感病毒雞胚尿囊腔傳代方法般采用孵化9-11日齡的雞胚，暗室內畫出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚頭一側氣室邊緣上方0.5cm處打一針孔；進針至尿囊腔內接種樣品0.1-0.2ml/胚，以融化的石蠟封孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24h內死亡雞胚，至96小時全部取出于4℃冰箱過夜。收毒：無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，肉眼觀察雞胚病理變化，尿囊液進行HA效價測定。對于HA效價<1:8的樣品，取上一代收獲尿囊液繼續以相同接種方式和劑量盲傳3代。在實際應用中，我們發現對于野外樣品(遷徙鳥糞、禽糞等)，存在外部環境的不可控性，樣本質量良莠不齊，即便對于同樣的一批樣本，因為各種不同的因素的影響，病毒分離率不盡相同。

發明內容：

針對上述問題，本發明提供一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法，采用增加處理病毒可感染的靶組織從而達到增加病毒分離幾率的目的，因此提高了病毒的分離率。

本發明一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法，按照以下步驟進行：收獲樣品接種雞胚的尿囊液、胚體，混合研磨，2500～4500rpm離心10～20min；取上清，繼續尿囊腔途徑盲傳，接種樣品0.1～0.3ml/胚。

所述的尿囊液、胚體混合時，尿囊液的體積與胚體組織的質量比為1～3ml/g。

本發明在雞胚水平的流感病毒分離的傳統傳代方法基礎上，通過增加處理病毒可感染的靶組織，采用胚體與尿囊液混合研磨接種的傳代方式，成功提高了野外樣品的流感病毒分離率，尤其對因高溫、強紫外線等特殊生境難以新鮮采集或質量不太理想的野外樣本進行“挽救性”的病毒分離，提供了一個有效、可明顯提高病毒分離率的處理方法。

具體實施方式

實施例1

采用傳統雞胚尿囊腔傳代法和本發明雞胚胚體混合傳代法，進行禽流感病毒分離率比較。同一份樣品同時采用兩種方法，分別各接種一枚雞胚。

樣品為2008年青海省某縣新鮮疑似禽流感野鳥樣品196份。具體操作方法如下：采用孵化9-11日齡的雞胚63枚，經照視后劃出氣室及胚胎位置，于氣室側方打一針孔；胚胎位置朝上橫置卵架上，直接進針尿囊腔內接種樣品0.2ml/胚，以融化的石蠟封孔閉兩個針孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24小時內死亡雞胚，至96小時全部取出于4℃冰箱過夜。收毒：無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼觀察雞胚病理變化(如胚體發育不良、有出血點、充血或出血等)，同時收獲雞胚胚體組織，尿囊液進行HA效價測定。傳代：HA實驗陰性的樣品，無菌取第1代尿囊液1.5ml，取胚體組織約1g，研磨，3000rpm離心15min，取上清0.2ml直接進針尿囊腔內接種樣品，作為第2代；96小時后收毒，檢測尿囊液HA效價，HA實驗仍為陰性的樣品，無菌取第2代尿囊液及胚胎組織，按上述同樣方式進行盲傳第3代，尿囊液進行HA效價測定。結果見表1。

比較例1