[發明專利]離心沉降輔助植物轉基因的方法

有效

• 申請號: 201410283216.3
• 申請日: 2014-06-23
• 公開（公告）號: CN104017825B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 王貴榮;李斌連;唐克軒
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及的是一種生物技術，具體是一種離心沉降輔助植物轉基因的方法。

背景技術

轉基因技術作為生物技術的核心在植物改良、醫藥、畜牧業和食品工業方面都具有巨大的發展潛力。然而以農桿菌轉化為主的植物轉基因技術目前存在轉化效率低下的問題，大部分植物的轉化率為1％左右，這個問題也成為了限制轉基因植物產業化生產的主要因素。研究表明，農桿菌浸泡受體植物材料時，只有表層的少數受創傷細胞有可能被轉化，而受體材料中的大部分內部細胞沒有機會接觸到農桿菌。針對這一問題，有人提出超聲波輔助農桿菌轉化的轉思路，這種處理可以增加受體材料表面的創傷程度，對于受體內部細胞來說效果甚微。

發明內容

本發明的目的，就是為了解決上述問題，提供一種離心沉降輔助植物轉基因的方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：一種離心沉降輔助植物轉基因的方法，包括如下步驟：

步驟一，通過植物組織培養技術，得到無菌的植物材料；

步驟二，從獲得的無菌植物材料中切取受體部位，作為轉化受體材料；

步驟三，將包含有目的基因的農桿菌活化到轉化狀態后，在5000-10000rpm條件下離心并重懸，得到農桿菌重懸液；

步驟四，把植物受體材料浸泡到農桿菌重懸液中，再次進行離心處理；

步驟五，將步驟四中離心處理后的材料轉移到無菌玻璃器皿中靜置15-20分鐘；

步驟六，靜置時間結束后，把感染后的植物材料從玻璃器皿中取出來，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，然后轉移到共培養基中共培養；

步驟七，共培養結束后，將感染過的植物受體材料在選擇壓力下進行篩選，最終獲得陽性轉化子。

步驟三中所述的轉化狀態，是指農桿菌液的OD值達到0.5-0.7。

步驟三中所述的重懸，是指將農桿菌在感染之前進行離心沉降后棄上清，然后用植物液體培養基把細菌重新懸浮起來。

步驟四中所述的離心處理是，在25℃下，5000-8000rpm離心5-10min。

本發明將植物受體材料與農桿菌混合后在合理的轉速下進行離心沉降處理，離心沉降不僅可以增加受體材料的創傷面積，而且使農桿菌在離心力作用下深入到受體材料內部，顯著提高了植物轉基因效率。

具體實施方式

下面對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

下面實施例的煙草來自本申請人的實驗室。

本實施例包括如下步驟：

步驟一，從無菌煙草組培苗中取糼嫩葉片，切去葉緣作為受體材料；

步驟二，將包含有GUS基因的農桿菌TG1活化到OD值＝0.6，在50000rpm條件下離心5分鐘，然后用MS液體培養基因重懸；

步驟三，把步驟一中的煙草受體葉片浸泡到農桿菌重懸液中，并在5000rpm條件下離心10min；

步驟四，把離心后的材料轉移到無菌三角瓶中靜置20分鐘；

步驟五，靜置時間結束后，把感染后的植物材料從三角瓶中取出來，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，然后轉移到共培養基中，黑暗條件下兩天；

步驟七，共培養結束后，將感染過的植物受體材料在添加頭孢霉素和卡那霉素的MS培養基中篩選；最終通過GUS染色獲得22株陽性轉化子。

本實施例發現，離心沉降輔助轉基因技術，可以使煙草轉基因效率提高一倍。