[發(fā)明專利]一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗的方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410280110.8
• 申請(qǐng)日: 2014-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN105311630B
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)S科;孫進(jìn)忠;王進(jìn)產(chǎn);田克恭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/295
• 分類號(hào): A61K39/295;C12N7/00;A61P31/14;A61P31/20
• 代理公司: 北京華夏正合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營(yíng)

本發(fā)明提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備疫苗方法，該方法包括以下步驟：(1)利用微囊化方法制備微囊化動(dòng)物細(xì)胞；(2)在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，接入該微囊化動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；(3)在該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中接入病毒進(jìn)行培養(yǎng)，收獲病毒液，制備疫苗。采用微囊化技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，解決了細(xì)胞大規(guī)模連續(xù)放大的問(wèn)題，還發(fā)現(xiàn)利用該培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞來(lái)繁殖病毒，病毒含量較高，用此病毒液來(lái)制備病毒疫苗同樣起到比較好的免疫效果。本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)制備細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的方法。本發(fā)明降低了對(duì)微載體的依賴，生產(chǎn)成本有較大的降低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)中目前最令人振奮的進(jìn)展之一是采用了微載體(Microcarr ier,MC)。最早由VanWezel所報(bào)道的這種載體,經(jīng)馬薩諸塞理工學(xué)院 (MIT)的研究小組廣泛工作以后已得到改進(jìn),并擴(kuò)充了應(yīng)用范圍。目前國(guó)際市場(chǎng)已有十幾種商品MC出售。目前常用的商品化微載體有 cytodex系列、biosilon系列、solo微載體、Cultipher微載體和Fibra disk 片狀載體等，這些微載體對(duì)用于細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，價(jià)格往往過(guò)于昂貴，用于大規(guī)模生產(chǎn)成本大，不適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

微囊化技術(shù)主要用于病毒疫苗和化學(xué)藥物的微膠囊化，通過(guò)微膠囊的緩釋作用，從而提高受試動(dòng)物的預(yù)防或治療效果。微囊化培養(yǎng)在疫苗研制中的應(yīng)用主要有以下幾方面。

在口服型疫苗中的應(yīng)用，利用微膠囊技術(shù)，把可口服的疫苗包裹住，制成耐酸堿可吸收的微膠囊。使用時(shí)通過(guò)飼料或飲水讓動(dòng)物攝入，經(jīng)消化道吸收以后，壁材逐漸打開，芯材(疫苗)流出刺激動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。微膠囊疫苗由于壁材的緩慢釋放，疫苗對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)期有效刺激，機(jī)體的免疫應(yīng)答效果也會(huì)十分確實(shí)、穩(wěn)定。利用這種技術(shù)用開發(fā)魚類的緩釋疫苗非常有意義。

在聯(lián)苗中的應(yīng)用，利用微膠囊技術(shù)，把兩種疫苗微包處理后再混合制成聯(lián)苗，由于不同疫苗壁材打開的時(shí)間各不相同，它所包含芯材(疫苗)釋放出的時(shí)間也有先后之分，利用微膠囊技術(shù)生產(chǎn)的聯(lián)苗，可以大大降低因同時(shí)免疫而產(chǎn)生的不同疫苗之間的拮抗作用，使機(jī)體對(duì)疫苗刺激產(chǎn)生一個(gè)合理的時(shí)間差，達(dá)到良好的免疫效果。

在基因工程疫苗研究中的應(yīng)用：基因工程蛋白，在動(dòng)物體內(nèi)降解快，一次免疫很難起到很好的保護(hù)效果，可通過(guò)微囊化技術(shù)把蛋白進(jìn)行微囊化，在不影響蛋白的抗原性的同時(shí)，還能延緩蛋白的免疫效果，已有文獻(xiàn)報(bào)道微囊化乙肝表面蛋白疫苗后的免疫效果比傳統(tǒng)工藝疫苗有較為明顯的提升，使用一次注射就能實(shí)現(xiàn)比較好的免疫效果。

另外微膠囊化基因工程細(xì)胞，可用于制備高濃度的表達(dá)產(chǎn)物。微囊化培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞是一種大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體的新技術(shù),國(guó)外已應(yīng)用于生產(chǎn),其主要優(yōu)點(diǎn)是單抗?jié)舛雀?純度高,活力高,易于純化。

在現(xiàn)有技術(shù)中未見有微囊化哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)病毒性疫苗的報(bào)道，主要是未解決大規(guī)模培養(yǎng)的瓶頸問(wèn)題。專利申請(qǐng)CN101288836公開了利用一種微生物微膠囊大量制備的方法，并具體公開了：配制海藻酸鈉溶液作為囊材，以氯化鈣溶液作為固化劑，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物種子液進(jìn)行固化，并將包有微生物細(xì)胞的微膠囊接入發(fā)酵液中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，過(guò)濾分離微膠囊獲得產(chǎn)品的技術(shù)方案。然而，該技術(shù)方案使用高壓空氣和噴頭的噴擠壓霧法，存在有產(chǎn)品粒徑過(guò)大的問(wèn)題，且球形度和單分散性都很差，使得產(chǎn)品得率低，同時(shí)制備過(guò)程比較復(fù)雜，因此極大限制了其推廣應(yīng)用。

專利申請(qǐng)CN103614344公開了一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型的方法，具體公開了培養(yǎng)PK-15細(xì)胞液，在生物反應(yīng)器內(nèi)接種上述細(xì)胞液，加入片狀微載體，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，所述PK-15細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至72小時(shí)接入豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，接種 24小時(shí)后至240小時(shí)采用灌注工藝培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒液與生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒液混合，凍融，得豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) 病毒液。然而，該申請(qǐng)使用價(jià)格昂貴的片狀載體，抗原生產(chǎn)成本較高；同時(shí)使用片狀載體后，細(xì)胞從載體上消化解離解離困難，不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)放大。