[發(fā)明專利]綠盲蝽唾液蛋白PG12的應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN105200025A
• 公開（公告）日: 2015-12-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張帥;崔金杰;王春義;雒珺瑜;呂麗敏;李春花
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12Q1/68;C12Q1/34;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域及植物病蟲害防治領(lǐng)域，具體地說，涉及綠盲蝽唾液蛋白PG12的應(yīng)用。

背景技術(shù)

盲蝽蟓(Heteroptera:Miridae)是一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲，它的寄主植物范圍廣泛，已報道有50余科200多種，包括棉花、棗、葡萄、櫻桃、蘋果、茶樹等多種重要作物。在取食過程中，若蟲和成蟲以針狀口器刺吸棉株柔嫩組織中的汁液，并從唾液腺分泌含有唾液酶的唾液進行體外預(yù)消化。另外在盲蝽蟓唾液中還存在造成棉花出現(xiàn)病理特征的致病蛋白，所以在盲蝽蟓危害棉花頂尖，致棉花頂芽干枯死亡，成為無頭棉；危害棉花頂尖，致棉花形成許多不定芽，成為多頭棉，表現(xiàn)枝葉叢生；危害棉花葉片后，侵害部位變黑，后形成孔洞，葉片長大后，孔洞也隨之變大，成為很多破洞，稱之為破葉瘋；幼蕾受到危害后由黃變黑，形似蕎麥粒，2-3天后脫落，中型蕾被害后苞葉張開，不久脫落；幼鈴受到危害后，輕者呈現(xiàn)褐色水浸斑，重者滿布黑點僵化脫落。

盲蝽不同于蚜蟲、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，屬細(xì)胞取食者。這類昆蟲取食時，先將口針插入植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，然后通過口針的劇烈活動撕碎植物細(xì)胞，同時分泌唾液，將食物源變成泥漿狀物質(zhì)后，再進行吸食。在分泌的唾液中含有大量唾液酶，其中多聚半乳糖醛酸酶和蛋白酶是主要組成成分。

Strong和Kruitwagen(1968)曾報道在草盲蝽的唾液中存在多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)活性，并推測有二到三種具有內(nèi)切、外切和水解活性的PGs蛋白存在，后來研究者證明草盲蝽的唾液中至少存在5種PGs蛋白。內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶隨機降解細(xì)胞壁的多聚α-1,4-半乳糖醛酸為低聚半乳糖醛酸，外切多聚半乳糖醛酸酶從末端降解細(xì)胞壁的多聚α-1,4-半乳糖醛酸產(chǎn)生單糖，還有一些PGs同時具有內(nèi)切和外切酶活性。到目前為止，在四紋盲蝽(Poecilocapsuslineatus)和美國牧草盲蝽(LygusLineolaris)唾液中也發(fā)現(xiàn)具有外切活性的PGs。同時，研究發(fā)現(xiàn)昆蟲唾液中的PGs蛋白由一個高度變異的基因家族控制，它編碼一系列的PGs來應(yīng)對植物體內(nèi)的PGs抑制劑，通過改變PGs蛋白的數(shù)量和種類來降解植物細(xì)胞壁的膠質(zhì)。通過構(gòu)建雄性草盲蝽若蟲的cDNA文庫，獲得276個ESTs序列，其中包括3種多聚半乳糖醛酸酶基因片段，通過cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)獲得這三個基因的全長序列。

病理反應(yīng)是一種普遍存在的現(xiàn)象，推測引起病理反應(yīng)的致病蛋白種類有多種類型。早在1970年就在草盲蝽的唾液中發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶的活性，Ecale和Backus(1995)的研究表明，可能是草盲蝽的機械損傷導(dǎo)致植物抗性反應(yīng)，草盲蝽的唾液可以放大這種反應(yīng)。草盲蝽唾液中的多聚半乳糖醛酸酶能使棉花和紫花苜蓿的花朵不正常發(fā)育，提取草盲蝽唾液蛋白并分離得到具有多聚半乳糖醛酸酶活性的部分,將其注射到植物幼花基部,會像草盲蝽取食植物幼花一樣,阻礙花朵發(fā)育。后來使用黑曲霉(Aspergillusniger)體外表達(dá)重組多聚半乳糖醛酸酶蛋白證明，多聚半乳糖醛酸酶的水解活性導(dǎo)致了苜蓿病理性反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供綠盲蝽唾液蛋白PG12的應(yīng)用。

本發(fā)明中涉及的PG12蛋白是由綠盲蝽(Apolyguslucorum)唾液腺分泌的一種具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白。PG12蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

PG12蛋白的編碼基因，具體可為如下①～③中任一所述的基因；

①其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示；

②在嚴(yán)格條件下與①所示序列雜交且編碼與多聚半乳糖醛酸酶合成相關(guān)的蛋白的DNA序列；

③與①或②所示序列具有90％以上(優(yōu)選95％以上)的同源性，且編碼與多聚半乳糖醛酸酶的合成相關(guān)的蛋白的DNA序列。

所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

其中，SeqIDNo.2所示序列第34-1089bp為編碼區(qū)，編碼SeqIDNo.1所示的蛋白。

本發(fā)明提供綠盲蝽唾液蛋白PG12在降解果膠中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供綠盲蝽唾液蛋白PG12在降解植物細(xì)胞壁中的應(yīng)用。

前述應(yīng)用中，綠盲蝽唾液蛋白PG12的制備方法包括以下步驟：