[發(fā)明專利]一種空腸彎曲桿菌感染相關雞microRNA的鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410276212.2
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104017888A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設計）人: 李顯耀;劉肖意;劉麗英;張懋志
• 申請（專利權）人: 山東農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種空腸彎曲桿菌感染相關雞microRNA的鑒定方法。

背景技術

空腸彎曲桿菌，一種重要的食源性病原菌，引起畜禽發(fā)病，引發(fā)人類急性腸炎，給人類帶來了嚴重的經(jīng)濟損失和食品安全問題，盲腸是其主要繁殖部位。宿主的遺傳背景在雞抵御空腸彎曲桿菌中起重要作用，不同品系(品種)的雞對空腸彎曲桿菌的易感性/抗性有顯著差異。

microRNA(miRNA)是一類長度約22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶基因3’UTR結合抑制靶基因的翻譯或?qū)Π谢蜻M行切割，在免疫和疾病等很多生物學過程中發(fā)揮重要作用，包括細菌、病毒感染。

近幾年，Solexa高通量測序技術成為各物種microRNA分析鑒定的有力工具，并且與細菌、病毒感染相關的雞microRNA已有研究，目前尚無通過Solexa測序技術分析鑒定與空腸彎曲桿菌感染相關的microRNA的研究。這是首次大規(guī)模的分析鑒定與雞空腸彎曲桿菌感染相關的microRNA，這將為我們深入研究microRNA在空腸彎曲桿菌中的作用機制奠定基礎，為雞的分子抗病育種提供理論基礎和科學依據(jù)。

目前還沒有針對空腸彎曲桿菌感染相關microRNA鑒定的研究，不存在鑒定空腸彎曲桿菌感染相關microRNA的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于設計一種新型的空腸彎曲桿菌感染相關雞microRNA的鑒定方法，解決上述問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種空腸彎曲桿菌感染相關雞microRNA的鑒定方法，包括步驟如下：

第一步，采集1日齡雞胎糞，通過特定培養(yǎng)基檢測空腸彎曲桿菌陽性率；

第二步，對空腸彎曲桿菌陰性雞只接種約10⁸cfu(菌類形成單位)空腸彎曲桿菌，對照組接種等量PBS，在接種后大于等于4個時間點采集盲腸內(nèi)容物用于空腸彎曲桿菌計數(shù)、采集盲腸組織樣品用于RNA提取；

第三步，根據(jù)空腸彎曲桿菌感染后的陽性率與動態(tài)變化結果，選擇雞對空腸彎曲桿菌感染敏感的時間點，采集雞盲腸組織為實驗材料；采用mirVana^TM?miRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，抽提所得總RNA經(jīng)安捷倫生物分析儀2100進行質(zhì)檢；處理組和對照組組內(nèi)分別進行混池，每個組內(nèi)均有2-3個混池；

第四步，按照“TruSeq小RNA樣品準備指南”對純化后的總RNA進行3′端接頭連接、5′端接頭連接、反轉(zhuǎn)錄、擴增和cDNA純化步驟，構建測序樣本文庫，其中處理組≥2，對照組≥2，并對所述測序樣本文庫進行質(zhì)檢；

第五步，對純化后的所述測序樣本文庫進行Solexa測序；

第六步，進行后續(xù)分析，包括小RNA測序產(chǎn)出的總讀數(shù)分布情況，比對數(shù)據(jù)庫信息、小RNA比對數(shù)據(jù)庫信息、以及小RNA的長度分布統(tǒng)計；

第七步，利用生物信息學方法分析鑒定感染與非感染雞盲腸組織中的差異表達的microRNA，預測其靶基因，并對靶基因的功能分類及所參與的信號通路進行分析；

第八步，綜合第六步與第七步中microRNA表達的差異顯著性、靶基因相關的顯著富集的基因本體論術語與信號通路結果，得出與空腸彎曲桿菌感染相關的microRNAs。

根據(jù)空腸彎曲桿菌感染雞后大于等于4個不同時間點盲腸中的細菌含量，確定雞對空腸彎曲桿菌感染反應敏感的1個時間點；

利用Solexa方法對處理組和對照組中大于等于4個個體進行混池測序，每個組內(nèi)的混池≥2；

根據(jù)microRNA本身及其靶基因的特性鑒定空腸彎曲桿菌感染相關的microRNA。

本發(fā)明涉及一種空腸彎曲桿菌感染相關雞microRNA的鑒定方法，包括步驟如下：

第一步，采集1日齡雞胎糞，通過特定培養(yǎng)基檢測空腸彎曲桿菌陽性率；

第二步，對空腸彎曲桿菌陰性雞只接種約10⁸cfu空腸彎曲桿菌，對照組接種等量PBS，在接種后大于等于4個時間點，采集盲腸內(nèi)容物用于空腸彎曲桿菌計數(shù)，采集盲腸組織樣品用于RNA提取；