[發(fā)明專利]一種空腸彎曲桿菌感染相關(guān)雞microRNA的鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410276212.2
• 申請(qǐng)日: 2014-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104017888A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李顯耀;劉肖意;劉麗英;張懋志
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種空腸彎曲桿菌感染相關(guān)雞microRNA的鑒定方法，其特征在于，包括步驟如下：

第一步，采集1日齡雞胎糞，通過(guò)特定培養(yǎng)基檢測(cè)空腸彎曲桿菌陽(yáng)性率；

第二步，對(duì)空腸彎曲桿菌陰性雞只接種約10⁸cfu空腸彎曲桿菌，對(duì)照組接種等量PBS，接種后大于等于4個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集盲腸內(nèi)容物用于空腸彎曲桿菌計(jì)數(shù)和盲腸組織樣品用于RNA提取；

第三步，根據(jù)空腸彎曲桿菌感染后的陽(yáng)性率與動(dòng)態(tài)變化結(jié)果，選擇雞對(duì)空腸彎曲桿菌感染敏感的時(shí)間點(diǎn)，采集雞盲腸組織為實(shí)驗(yàn)材料；采用mirVana^TM?miRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，抽提所得總RNA經(jīng)安捷倫生物分析儀2100進(jìn)行質(zhì)檢；處理組和對(duì)照組組內(nèi)分別進(jìn)行混池，每個(gè)組內(nèi)均有2-3個(gè)混池；

第四步，按照“TruSeq小RNA樣品準(zhǔn)備指南”對(duì)純化后的總RNA進(jìn)行3′端接頭連接、5′端接頭連接、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和cDNA純化步驟，構(gòu)建測(cè)序樣本文庫(kù)，其中處理組≥2，對(duì)照組≥2，并對(duì)所述測(cè)序樣本文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢；

第五步，對(duì)純化后的所述測(cè)序樣本文庫(kù)進(jìn)行Solexa測(cè)序；

第六步，進(jìn)行后續(xù)分析，包括小RNA測(cè)序產(chǎn)出的總讀數(shù)分布情況，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)信息、小RNA比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)信息、以及小RNA的長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)；

第七步，利用生物信息學(xué)方法分析鑒定感染與非感染雞盲腸組織中的差異表達(dá)的microRNA，預(yù)測(cè)其靶基因，并對(duì)靶基因的功能分類及所參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析；

第八步，綜合第六步與第七步中microRNA表達(dá)的差異顯著性、靶基因相關(guān)的顯著富集的基因本體論術(shù)語(yǔ)(GO?Tterm)與信號(hào)通路結(jié)果，得出與空腸彎曲桿菌感染相關(guān)的microRNAs。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的空腸彎曲桿菌感染相關(guān)雞microRNA的鑒定方法，其特征在于：

根據(jù)空腸彎曲桿菌感染雞后大于等于4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)盲腸內(nèi)細(xì)菌含量，確定雞對(duì)空腸彎曲桿菌感染反應(yīng)敏感的1個(gè)時(shí)間點(diǎn)；

利用Solexa方法對(duì)處理組和對(duì)照組中大于等于4個(gè)個(gè)體進(jìn)行混池測(cè)序，每個(gè)組內(nèi)的混池≥2；

根據(jù)microRNA本身及其靶基因的特性鑒定空腸彎曲桿菌感染相關(guān)的microRNA。