[發明專利]一種蟲草抗菌肽及其制備方法

有效

• 申請號: 201410275880.3
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號: CN104017050A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 周禮紅;高燕燕;丁旭
• 申請（專利權）人: 周禮紅
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12P21/02;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/26;C07K1/18;C12R1/645
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

技術領域

本發明涉及微生物領域，具體而言，涉及一種蟲草抗菌肽及其制備方法。

背景技術

抗菌肽是生物體免疫系統為抵御外源性病原微生物入侵而產生的一類多肽物質，是先天免疫的重要組成成分。目前，在抗菌肽數據庫(Antimicrobial?Peptide?Database，APD)中已經有2353條抗菌肽，其中有215個細菌素，305個植物抗菌肽，12個真菌抗菌肽和1773個動物宿主防御肽。

由于抗菌肽能夠抑制革蘭氏陽性和陰性細菌、真菌、病毒及寄生物等。此外，抗菌肽還對免疫系統具有調控作用。相比傳統抗生素抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩定性好、殺菌快速、作用專一、多樣化的應用潛力以及不易產生耐藥性等優點。因此，抗菌肽有望成為新型的抗菌藥物。目前，已有幾種抗菌肽進入臨床研究，多種抗菌肽應用于食品保鮮以及飼料添加劑。

抗菌肽的分布極為廣泛，在病毒、細菌到植物、昆蟲、軟體動物、甲殼動物、兩棲動物、魚類、鳥類及哺乳動物等生物中均有發現。具體的，抗菌肽是由基因編碼的一類多肽。所有抗菌肽均是由一段包含信號序列的前體翻譯后修飾而來。在不同生物體內，分泌抗菌肽的部位不盡相同，抗菌肽的氨基酸組成也相差甚遠。根據其氨基酸組成及結構特點，一般將抗菌肽分為以下五種類型：線性陽離子α-螺旋抗菌肽、富含特殊氨基酸的陽離子抗菌肽、含有二硫鍵的抗菌肽、陰離子抗菌肽、大型蛋白質的片段。α-螺旋型抗菌肽是其中一大類，在自然界廣泛存在，它們與細菌細胞膜互作，依靜電引力靠近并結合在質膜表面，隨之疏水結構域插入質膜中，當抗菌肽達到一定濃度后，通過分子聚集和膜內分子間相互位移破壞細胞膜穩定性，增加膜通透性，形成離子通道，引起去極化；或形成較大通道，使細胞內容物外泄，最終導致細胞死亡。

蛹蟲草是藥食兩用的新資源食品，是唯一實現規模化人工種植的蟲草真菌。研究表明，蟲草多肽在毫克水平就能發揮作用，安全評價藥理和功能檢測結果也證明蟲草多肽無毒、無副作用、營養價值和生物利用率均極高。因此，以蛹蟲草為研究材料，制取蟲草多肽，并進行應用是相關領域中的研究熱點。

在相關技術中，通常利用堿性蛋白酶水解蛹蟲草子座熱水浸提蟲草素后的剩余物；再通過電泳進行分離純化，獲得分子量在3180～5620之間的多肽混合物。這些多肽混合物雖具有一定的清除自由基、抗脂質過氧化的能力；但是，均不能體現出抑菌活性。進而嚴重了限制了其推廣應用。

綜上，以蛹蟲草為了來源，制取一種具有抑菌活性的蟲草抗菌肽是本領域亟待解決的一個技術問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種蟲草抗菌肽及其制備方法，以解決上述的問題。

在本發明的實施例中提供了一種蟲草抗菌肽，其從蛹蟲草菌株中分離得到，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；經過抗菌實驗測定，其對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抑菌作用，體現出了抑菌活性，實現了從蛹蟲草中獲取具有抑菌活性的抗菌肽的技術效果，進而可進行全面的推廣應用。

本發明的實施例中提供的這種蟲草抗菌肽的制備方法具體包括以下步驟：

步驟A：將蛹蟲草菌株斜面菌種接入到薩氏瓊脂改良固體培養基中，培養至產生斜面孢子；利用無菌水將得到的所述斜面孢子洗下，并轉接到三角瓶中，振蕩培養，得到孢子懸液；

步驟B：將所述孢子懸液轉接到薩氏液體培養基中，恒溫振蕩培養之后靜置、過濾，得到菌絲體；

步驟C：將所述菌絲體烘干至粉末狀后加入蒸餾水，提取過夜后過濾，得到濾液；

步驟D：將所述濾液進行旋轉蒸發濃縮，并同時加入飽和硫酸銨溶液，靜置后離心，得到第一濃縮液，在所述第一濃縮液中再次加入飽和硫酸銨溶液，得到預定飽和度的第二濃縮液，將所述第二濃縮液離心，得到沉淀樣品，在所述沉淀樣品中加入蒸餾水進行溶解，得到樣品溶解液；將所述樣品溶解液利用蒸餾水透析后冷凍干燥，得到粗蛋白樣品；

步驟E：將所述粗蛋白樣品利用CM-52陽離子交換柱進行洗脫，得到洗脫組份，再將洗脫組份透析后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到14KD的蛋白質條帶；

步驟F:切下所述蛋白質條帶，并進行液質聯用質譜檢測，得到質譜數據，并進行分析，得到蟲草抗菌肽及其序列。

通過發明實施例提供的這種制備方法可實現以蛹蟲草菌株為來源，獲得具有抑菌活性的蟲草抗菌肽。

可選的，在步驟A中：所述薩氏瓊脂改良固體培養基，按照重量份數計，其有效組份包括：

麥芽糖4-6份、蛋白胨8-12份、酵母膏4-6份、瓊脂18-22份、葡萄糖18-22份、水900-1100份。

可選的，在步驟A中：