[發(fā)明專利]一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410274790.2
• 申請日: 2014-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN104034897A
• 公開（公告）日: 2014-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李永鋒;陳國勇;傅汝毅;陶玲云;藍(lán)文苑
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西博士海意信息科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李珊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種豬瘟病毒快速檢測試劑盒。

背景技術(shù)

豬瘟病毒是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm，核衣殼是立體對稱二十面體，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。豬瘟病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制,不能凝集紅血球，與牛腹瀉病毒有相關(guān)抗原。該病毒對乙醚敏感，對溫度、紫外線、化學(xué)消毒劑等抵抗力較強(qiáng)。

利用RT-PCR檢測類病毒是一種非常靈敏的方法。通常RT-PCR靈敏度比cRNA探針的斑點(diǎn)雜交靈敏度高10-100倍（Nakahara?et?al,?1999）。RT-PCR對模板的純度要求高，如果檢測樣品中存在擴(kuò)增抑制物的話，將很難擴(kuò)增出目的條帶，尤其是果樹類的材料，含有大量的多酚類和糖類等。糖類一般可以用乙二醇單甲醚來去除。PVP能有效束縛酚類化合物，在PCR混合物中加入PVP能有效地除去從組織中制備的RNA中的阻遏物（Koonjul?et?al,?1999）。但是PCR產(chǎn)物的檢測常規(guī)方法是采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，電泳后需要進(jìn)行溴化乙錠染色后在紫外光下觀察，溴化乙錠對人具有中等毒性和致癌性，易造成環(huán)境污染，這也嚴(yán)重限制了此方法的推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題而專門研制的一種豬瘟病毒的快速檢測試劑盒，快速，靈敏，準(zhǔn)確檢測出帶有錦紫蘇類病毒的植株。

本發(fā)明的試劑盒主要由以下幾種試劑和層析試紙條組成：

試劑A：病毒RNA提取液,由常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)的RNA提取液構(gòu)成；

試劑B:?包括10×One?step?RNA?PCR?buffer，MgCl2，DNTP?Mixture，RNase?Inhibitor，AMV-Optimized?Taq，AMV?RTase，正向引物，反向引物,所述正向引物，反向引物分別標(biāo)記了地高辛、熒光素，所述正向引物（F-primer）序列為5’-ACGGAGGGACTAGCCGTAGTG-3’，

反向引物（R-primer）序列為5’-CTGTTAGTGGGCCTCTGCAGC?-3’；

試紙條：由玻璃纖維膜、NC膜、吸水紙和雙面膠塑料板組成，硝酸纖維素膜（NC膜）粘貼在雙面膠塑料板上，玻璃纖維膜和吸水紙分別粘貼在NC膜的兩側(cè)并且與NC膜有部分重疊；NC膜上有T點(diǎn)（檢測點(diǎn)）和C點(diǎn)(質(zhì)控點(diǎn))，T點(diǎn)位于靠近玻璃纖維膜的一側(cè)，玻璃纖維膜上固定有膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛抗體，T點(diǎn)固定的是鼠抗熒光素抗體，C點(diǎn)固定的是羊抗兔多克隆抗體。

本劑盒中試紙條中所述的膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛抗體的溶液配制方法為：

（1）取純化好的兔抗地高辛多克隆抗體300?μg，在磁力攪拌下緩慢加入膠體金溶液18?mL，室溫?cái)嚢?0?min；

（2）加入10%牛血清白蛋白1?mL，室溫?cái)嚢??min；

（3）加入10%聚乙二醇0.4?mL，室溫?cái)嚢??min；

（4）12，000?r/min，離心30?min，去上清，加入2?mL保存液（取四硼酸鈉0.1?g，BSA?0.25?g，溶于250?mL蒸餾水）懸浮沉淀；

（5）加入8?mL稀釋液（取Na2HPO4·12H2O?6.1?g，NaCl?8.5?g，PVP40?5?g，硼酸?2.1?g，PEG?1?g，10%?BSA?50?mL，溶于1000?mL蒸餾水），取小量進(jìn)行檢定，其余置4℃保存。

上述步驟（1）中的膠體金溶液的制備法如下：

a．取1%氯金酸0.6?mL，加30?mL超純水加熱煮沸；

b．加37℃預(yù)熱的1%檸檬酸鈉溶液0.9?mL，快速一次加入，溶液由藍(lán)逐漸變?yōu)樽霞t色，煮沸3-5?min，補(bǔ)水至總體積31.5?mL；

c．冷卻后，用0.2?mol/L?K2CO3調(diào)pH至8.0-9.0，用0.45?μm濾膜過濾，4℃保存。

本試劑盒中試紙條玻璃纖維素膜上固定有膠體金標(biāo)記的兔抗地高辛多克隆抗體，T點(diǎn)上噴有鼠抗熒光素單克隆抗體；C點(diǎn)上噴有羊抗兔多克隆抗體。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：設(shè)計(jì)和優(yōu)化了一種檢測豬瘟病毒的通用引物，并與核酸膠體金層析試紙條技術(shù)聯(lián)用，設(shè)計(jì)成試劑盒，在短時(shí)間內(nèi)即可完成不同種錦紫蘇類病毒的PCR產(chǎn)物的檢測，不需要電泳和溴化乙錠的染色，更為快速實(shí)用，簡單，靈敏，且安全無污染。

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具體實(shí)施方式

1.樣品RNA的提取：