[發明專利]一種桉樹焦枯病原菌的雙重PCR檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201410273170.7
• 申請日: 2014-06-18
• 公開（公告）號: CN104017884A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 朱天輝;張靜;朱涵明月;李姝江;譙天敏;韓珊;王淋敏;張麗娜
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種桉樹焦枯病原菌的雙重PCR檢測試劑盒及其使用方法。

背景技術

桉樹(Eucalyptus?spp.)是世界三大速生造林樹種之一，在我國生態環境建設以及解決生物能源問題中發揮著不可替代的作用，具有重要的經濟、社會、生態效益。但目前，由桉樹病原真菌所引起的桉樹焦枯病嚴重影響著桉樹材積量的生產，造成巨大的經濟損失，極大地威脅著我國林業生產建設，其中在我國主要引起桉樹焦枯病的病原真菌為Cylindrocladium?scoparium。

桉樹焦枯病原菌危害桉樹葉片和枝梢，尤其是危害苗木和4年生以下的幼樹，主要特征是葉片和嫩莖上有壞死性病斑。葉片感染初期出現針頭狀水漬小斑。病斑逐漸擴大為不規則的壞死狀黃褐色病斑，壞死如被灼傷樣，邊緣的病斑有一褪綠赤褐色暈圈；后期病斑中部變淺色有輪紋狀或不明顯，多數葉緣的病斑連接。然后向中間發展，病葉部位脆易裂，形成典型爛葉癥狀。嚴重感病的苗木葉片全部脫落、頂枯。幼樹感病后葉片由下而上脫落2/5-4/5，甚至全脫光禿，個別整株死亡。病原菌侵染枝條后，枝條表皮遍布近圓形或長條形的小褐斑，若病斑環繞小枝，枝條即干枯。在雨后或高濕環境，尤其靠近地面枝葉的壞死部分，出現密布白色點狀物，其為病原苗的孢子堆。因此，探求快速、準確的檢測桉樹焦枯病原菌的有效方法是桉樹焦枯病害防治的前提條件。

近年來，分子生物學技術迅速發展，真菌基因轉錄間隔區也大量被使用在真菌鑒定和分子檢測體系中。真菌基因轉錄間隔區(internal?transcribed?spacer,ITS)，它首先由Gonzalez在1990年提出，隨后逐步發展起來的全新的分子標記。ITS檢測的優點在于：具有高拷貝數；同時包含保守與變異序列；能根據保守序列中的變異設定通用引物進行擴增比較。ITS是一種簡單、快速、準確、靈敏度高、易于操作的分子標記技術，現在廣泛應用于真菌的分類鑒定、病原菌的分子檢測和病害診斷等研究中。由于ITS的序列分析對真菌屬、種的分類具有穩定性，能實質性地反映同一屬內不同種間及種內菌株間的序列差異，因此，ITS序列分析被廣泛的應用到了真菌屬種分類研究的領域中。分子檢測的方法解決了傳統方法只能依靠病原菌的形態學、致病性測定來檢測病原菌，而無法做到的病害早期檢測。對ITS序列的研究不僅能解決許多形態學分類研究中的疑難問題而且在對植物病原菌的檢測和鑒定上起到了事半功倍的效果。此外，對于桉樹焦枯病原菌分子檢測技術國內在這方面的報道相對有限，因此努力加強研究桉樹焦枯病原菌的分子檢測也有助于生物學的全面發展。

傳統真菌的鑒定主要是通過形態學和生理生化指標。形態學鑒定菌株是普遍采用的方法，但耗時、繁瑣、需要較高的專業技術知識。形態學鑒定必須是在分離培養得到病原物的基礎上才能開展，對有些培養條件特殊及形態結構不易區分的一些種的鑒定上顯得非常困難，且真菌種類繁多、個體多態性明顯，有些真菌在生長的過程中由于受到環境的壓力，其形態特征和生理生化指標發生變化，使得其形態特征復雜化，從而給分類和檢測帶來困難和不準確性。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術在檢測桉樹焦枯病原菌中存在的不足，提供了一種桉樹焦枯病原菌的雙重PCR檢測試劑盒及其使用方法。

本發明的技術方案如下：

一種桉樹焦枯病原菌的雙重PCR檢測試劑盒，其包括：

(1)10×PCR?Buffer；

(2)25mmol/L?Mg²⁺；

(3)10mmol/L?dNTP；

(4)引物：10mmol/L?CYS1，10mmol/L?CYS2，10mmol/L?EF-S-1，10mmol/L?EF-A-1；其中，引物序列為：CYS1：5＇－CCAGAGGACCCAACAAAC－3＇，CYS2：5＇－CCAGAGCGAGGTGTATTAC－3＇，EF-S-1：5＇－GCAAGAGTCGGATGGAAT－3＇，EF-A-1：5＇－TTGATTGACACTGTGCTAAC－3＇；

(5)5U/μL?Tag聚合酶；

(6)ddH₂O。

所述的桉樹焦枯病原菌的雙重PCR檢測試劑盒的使用方法，其步驟如下：

(1)提取純培養菌株基因組DNA或所取植物組織樣總DNA；