[發明專利]快速篩選香蕉抗病相關基因的細胞模型

在審

• 申請號: 201410267550.X
• 申請日: 2014-06-16
• 公開（公告）號: CN104004703A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 黃霞;蔡穎欣
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于基因功能研究領域，特別涉及一種快速篩選香蕉抗病相關基因的細胞模型。

背景技術

由于病蟲害日益猖獗，香蕉生產面臨著嚴峻的考驗，培育并種植抗病品種被認為是防治病蟲害的最經濟、最有效的措施，是香蕉產業可持續發展的保證。克隆香蕉的抗病相關基因并進行功能研究既是香蕉遺傳改良的重要基礎，也是揭示抗病機制的必要環節。在進行香蕉抗病功能基因研究時，當克隆到一個基因后，一般先對它進行表達分析，以確定該基因是否與香蕉抗病反應相關。目前，通過基因表達分析篩選香蕉抗病相關基因的方法主要是：將香蕉組培苗移栽后，人工接種病原菌，于不同時間取材，分別提取RNA，然后采用半定量RT-PCR、實時熒光定量PCR或Northern雜交技術分析目的基因的表達模式?，F有的獲得用于進行基因表達分析篩選香蕉抗病相關基因的植物材料的方法是將香蕉組培苗移栽網/溫室，待張出6～8片展開葉片后，分別人工接種病原菌，于不同時間取材。這一方法涉及到香蕉植株種植，需要耗費比較多的人力、物力、財力、時間和空間，而且取材結束后對接種了病原菌的剩余植株、土壤和容器等的滅菌處理也非常耗時耗力。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種快速篩選香蕉抗病相關基因的細胞模型。本發明利用香蕉抗病和感病品種的懸浮培養細胞與病原菌粗毒素模擬寄主與病原菌的相互作用，在其相互作用下，香蕉抗病反應的正調控基因的激活表達在抗病品種的細胞中比感病品種的細胞中更強、更快或持續時間更長，而香蕉抗病反應的負調控基因的表達抑制在抗病品種的細胞中比感病品種的細胞中更強烈。表達模式既有差別就可以通過實時熒光定量PCR技術篩選出香蕉抗病相關基因。本發明利用細胞培養技術操作在時間和空間上的優勢，通過實時熒光定量PCR技術分析目的基因在抗病品種和感病品種的細胞中的表達差異，從而確定目的基因對香蕉抗病性的影響，為香蕉抗病相關基因的篩選提供了一種省時省力、快速有效的新方法。

本發明的再一目的在于提供所述快速篩選香蕉抗病相關基因的細胞模型的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種快速篩選香蕉抗病相關基因的細胞模型，其制備方法包括如下步驟：

(1)病原菌培養，誘導產生病原菌毒素，將病原菌毒素分離提取，得到病原菌粗毒素，貯存備用；

(2)將步驟(1)中得到的病原菌粗毒素分別加入香蕉抗病和感病品種的懸浮細胞培養系統，誘發香蕉細胞抗病反應，并分別收集香蕉細胞，即建立了可用于快速篩選香蕉抗病相關基因的細胞模型。

步驟(1)所述的病原菌包括導致香蕉病害的真菌、細菌或病毒等；

步驟(1)中所述的病原菌優選為香蕉枯萎病菌4號生理小種(Fusarium?oxysporum?f.sp.cubense?race4，FOC?race4)；

步驟(1)中所述的誘導的條件優選為每40～60mL馬鈴薯液體培養基中接種一塊病原菌菌絲體，于24～26℃持續光照條件下，120～150rpm振蕩培養10～14天；

所述的病原菌菌絲體優選為病原菌于馬鈴薯固體培養基上，24～26℃光照培養6～8天，切取面積1～1.5cm²的菌絲體；

步驟(1)中所述的分離的條件優選為將誘導后所得菌液首先使用4層滅菌紗布過濾，再經雙層濾紙過濾收集培養濾液；取100mL培養濾液以8000rpm離心15min，取上清液于旋轉蒸發儀中，50℃旋轉蒸發濃縮至10mL，用等體積乙酸乙酯萃取，收集水相，再用乙酸乙酯重復萃取2次；最后收集到的水相于50℃旋轉蒸發濃縮，用蒸餾水稀釋至50mL，即得到病原菌粗毒素；

步驟(2)中所述的病原菌粗毒素，與懸浮細胞培養系統優選按體積比1:19.5的比例混合；

步驟(2)中所述的懸浮細胞培養系統由香蕉懸浮細胞的細胞沉淀和香蕉細胞懸浮培養基按體積比0.5:19比例混合；

所述香蕉細胞懸浮培養基組成為：以MS培養基為基本培養基，添加1mg/L生物素、100mg/L谷氨酰胺、100mg/L麥芽提取物、1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸和45g/L蔗糖，高壓滅菌前pH為5.3；

所述的香蕉懸浮細胞的細胞沉淀優選通過如下步驟制備；分別取在香蕉細胞懸浮培養基中繼代培養3～5天的大蕉和巴西蕉懸浮細胞，4000～5000rpm離心8～10分鐘，去上清，即得細胞沉淀；

步驟(2)中所述的誘發香蕉細胞抗病反應的條件優選為26±1℃，90～110rpm黑暗振蕩培養；