[發明專利]基于微滴和納米熒光探針的胞內蛋白檢測方法

有效

• 申請號: 201611149908.4
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106596487B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 張濤;黎海文;蔣克明;周武平;劉聰
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 韓飛

本案涉及基于微滴和納米熒光探針的胞內蛋白檢測方法，其將待測細胞懸液加入到微流控芯片的第一樣品孔，將納米熒光探針復合物和細胞裂解液加入到第二樣品孔，將流動相加至流動相孔，驅動待測細胞懸液、納米熒光探針復合物、細胞裂解液和流動相進入微流控管道，在流體剪切力作用下生成油包水微滴；在37℃孵育20?60min，使待測細胞懸液中的細胞裂解后釋放出胞內蛋白并與納米熒光探針復合物結合；采用數字PCR系統或熒光拍照檢測微滴的熒光強度，從而測出胞內蛋白的含量。本案無需常規流式細胞術和免疫熒光檢測方法中的固定、打孔破膜，避免了抗原結合位點損失，簡化了操作步驟、提高了檢測靈敏度。

技術領域

本發明涉及一種胞內蛋白檢測方法，特別涉及一種基于微滴和納米熒光探針的胞內蛋白檢測方法。

背景技術

在單細胞水平上分析細胞內部組分是當前生物醫學研究的迫切需求，隨著單細胞測序、單細胞轉錄組等技術的不斷發展，人類從DNA、RNA的水平深入了解細胞群體異質性。在蛋白質檢測方面，免疫熒光染色和流式細胞術是最常用的單細胞胞內蛋白檢測方法。但免疫熒光染色和流式細胞術檢測時，需要對細胞進行固定，打孔，以便使細胞膜變得可滲透，然后孵育抗體，標記待檢測靶蛋白。這種方法步驟繁瑣，操作時間長，而且對固定、打孔步驟所用的試劑濃度和反應時間要求較高，固定不完全或打孔時間過長會導致細胞破裂，打孔時間過短則會導致抗體無法充分進入細胞同胞內蛋白結合，影響胞內蛋白檢測的準確性。此外現有的固定方法如醛固定術等盡管可以保存細胞的形態，但是許多抗原位點也被固定方法破壞，影響蛋白檢測的靈敏度和準確度。因此亟需一種快速、靈敏、穩定的單細胞胞內蛋白檢測方法。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本案提供一種基于微滴和納米熒光探針的胞內蛋白檢測方法。

微流控技術是在微米級結構中操控納升至皮升體積流體的科學技術，由于微結構的尺寸與細胞在同一尺度，而且在微流控芯片上進行生化反應具有試劑和樣品量少、快速實時、大量樣本平行處理、防止樣品交叉污染等諸多優點，微流控技術已成為單細胞分析的有力工具。

數字微滴技術利用微流控芯片中流體的剪切力得到微小體積(1fl-10²nl)的微滴，微滴間無交叉污染，微滴可快速連續產生，可在幾分鐘內完成數萬個微滴的生成與檢測，而且芯片設計加工相對簡單，已被用于細胞的高通量快速分選、蛋白、核酸檢測等領域。

納米材料尺寸分布特殊，具有表面效應、小尺寸效應以及宏觀量子隧道效應，從而表現出一系列獨特的電學、光學、磁學性能，將納米材料用于生物分子標記，可顯著提高檢測的靈敏度。將納米顆粒同熒光探針結合的納米熒光探針技術已被用于單細胞RNA檢測。但該技術依賴胞吞作用，無法快速準確測定細胞核酸的即時含量。因此，將數字微滴技術同納米熒光探針技術相結合，可以在單個微滴內實現單個細胞的快速捕獲、裂解、探針結合和檢測，避免了細胞固定、打孔等繁瑣步驟，將顯著提高檢測速度和檢測通量，實現單細胞胞內蛋白的快速、靈敏探測。

本案通過以下技術方案實現：

一種基于微滴和納米熒光探針的胞內蛋白檢測方法，其包括：

1)制備納米熒光探針復合物；

2)將待測細胞懸液加入到微流控芯片的第一樣品孔，將所述納米熒光探針復合物和細胞裂解液加入到所述微流控芯片的第二樣品孔，將流動相加至所述微流控芯片的流動相孔，驅動待測細胞懸液、納米熒光探針復合物、細胞裂解液和流動相進入所述微流控芯片的微流控管道，并在流體剪切力作用下生成油包水微滴，待測細胞懸液中的細胞、納米熒光探針復合物和細胞裂解液均被包裹在微滴中；

3)在37℃孵育20-60min，使微滴中的細胞裂解后釋放出胞內蛋白并與納米熒光探針復合物結合；

4)采用數字PCR系統或熒光拍照檢測微滴的熒光強度，從而測出胞內蛋白的含量。