[發明專利]一種副溶血性弧菌分子檢測方法及使用的引物對

無效

• 申請號: 201410262381.0
• 申請日: 2014-06-12
• 公開（公告）號: CN104017877A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 姚火春;慕艷娟;潘子豪
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，涉及一種副溶血性弧菌分子檢測方法及使用的引物對。

背景技術

副溶血性弧菌(vibrio?parahaemolyticus，Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽性細菌，屬弧菌科(Vibrio)弧菌屬，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚類、蝦類、貝類、牡蠣等海產品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海產品而引起中毒。我國每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的報道，近年來世界發病率呈上升趨勢。目前，對于副溶血弧菌的傳統檢測方法大多要經過前增菌、選擇性增菌、選擇性培養、生化鑒定、神奈川現象和血清學反應等過程。這些實驗操作繁瑣,需耗時5-6天，給海產品生產、出入境檢驗檢疫、食品衛生監督等帶來困難，影響經濟發展。目前，學者對副溶血弧菌的分子檢測的方法大多基于tlh、tdh、gyrb、pr72H等基因，但大多方法被后來的試驗數據否定，而現在缺乏可被公眾認可的分子檢測方法。故建立一種簡便、快速特異而嚴謹的分子檢測技術迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一對用于副溶血性弧菌分子檢測的特異性引物對。

本發明的另一目的是提供該引物對的應用。

本發明的又一目的是提供一種副溶血性弧菌分子檢測方法。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

本發明引物設計和分子檢測方法的建立基于副溶血性弧菌的toxRS基因。ToxRS，即toxR和toxS，為弧菌的毒素操縱子基因，toxS基因序列位于toxR下游，兩者的連續基因合稱為toxRS?；谠摶虻目勺儏^設計引物，建立副溶血弧菌的分子檢測方法。

一對用于副溶血性弧菌分子檢測的特異性引物對，上游引物toxRS-F為SEQ?ID?NO.1，下游引物toxRS-R為SEQ?ID?NO.2。

本發明所述的引物對在制備檢測副溶血性弧菌的檢測試劑中的應用。

一種用于副溶血性弧菌分子檢測的試劑盒，包含本發明所述的特異性引物對。

本發明所述的試劑盒，還包含Taq?PCR?Master?Mix。

本發明所述的引物對在檢測副溶血性弧菌中的應用。

一種副溶血性弧菌分子檢測方法，使用所述的特異性引物PCR擴增待檢樣品的DNA，如果能夠擴增得到679bp的片段，則說明待檢樣品中含有副溶血性弧菌。

所述PCR擴增的反應體系為25μl：2×Taq?PCR?Master?Mix12.5μl，dd?H₂O9.5μl，上游、下游引物各1μl，DNA模板1μl；反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共30個循環，最后72℃延伸10min。

有益效果：

副溶血性弧菌PCR檢測方法的建立，要求既不能出現假陽性——即嚴格的種特異性，也不能出現漏檢——即重復性良好，故要選擇種特異性的靶基因，并排除特異血清型、亞型以及毒力基因序列。本發明在參考大量文獻以及分析基因序列的基礎上，排除毒力基因、亞型以及血清型特異基因，鎖定副溶血弧菌可能存在的種特異性序列。引物的特異性與靶基因的特異性的起著同等重要的作用，對于副溶血性弧菌的檢測特異性和靈敏度具有著重大的影響。本發明經過反復比對和篩選，確定了以toxRS基因(GenBank編號L11929.1)的第579—1258個堿基作為靶序列，并設計了特異性引物對toxRS-F/toxRS-R，從理論層面保證本方法具有很高的特異性。

本試驗用2×Taq?PCR?Master?Mix替代傳統PCR體系中的10×buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶，省時省力且減小操作誤差。PCR程序中，較高的退火溫度能在一定程度上能提高引物的特異性，但并不代表越高越好。故應在能遵循特異性、重復性、靈敏性良好的基礎上，選擇最高的退火溫度。試驗結果證明，59℃為最適退火溫度。最終確定的PCR程序參數為：94℃預變性5min，94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共30個循環，最后72℃延伸10min。