[發明專利]與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選與應用

有效

• 申請號: 201710196769.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106872630B
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 楊靜華;陳新駿;呂鑫;趙涵;李翠玲;畢白斌;鞏晶;王鳳芹;孫勝楠;王興元;陳子江;楊靜鳴
• 申請（專利權）人: 山東大學;南京山諾生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取精子細胞全蛋白；

(2)將精子細胞全蛋白采用凝膠電泳分離，切膠酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品；

(3)將步驟(2)的樣品采用納流液相色譜分離，經納流液相色譜分離后的樣品再進行質譜檢測；

納流液相色譜分離的色譜條件為：流動相A：含有0.1％甲酸的水，流動相B：含有0.1％甲酸的乙腈；每個樣品分別用13.5μL A相溶解，樣品進樣量為4μL，納流液相質譜分析系統為Thermo Scientific研發的Orbitrap Elite；

樣品分離之前分別用4μL A相平衡自制的預柱和分析柱；預柱和分析柱的規格分別為：尺寸為4cm×150μm I.D.C18填料粒徑5μm,的預柱，尺寸為30cm×75μm I.D.,C18填料填充，粒徑3μm,的分析柱，預祝和分析柱均購自Dr.Maisch GmbH,Germany公司；平衡之后樣品在A相的帶動下首先載樣于預柱，然后在不同梯度下進行液相分離；

150min色譜梯度變化如下：5-32％流動相B 100min；32-80％流動相B，20min；80％流動相B，30min；流速為300nL/min；經過納流液相分離的樣品直接進入ESI離子噴霧源并進入Orbitrap Elite質譜儀中進行質譜檢測，采集數據；

(4)利用非限定氨基酸蛋白質修飾分析方法對質譜數據進行搜索，再經過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常個體和重度少弱精個體精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白非編碼氨基酸位點，即為診斷和/或治療重度少弱精子疾病的生物標志物。

2.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，提取精子細胞全蛋白采用的方法為：將精子樣本采用DPBS洗滌，加入RIPA裂解液超聲1～2min，置于冰上孵育30min裂解，離心，取上清。

3.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，在4℃的條件下離心，離心轉速為14,000g，離心時間為20min。

4.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，采用10％聚丙烯酰氨凝膠電泳對蛋白進行分離。

5.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，采用ziptip對酶解后的肽段進行脫鹽。

6.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)中，質譜檢測的條件為：350-1800m/z的全掃描，分辨率為60,000，荷質比為200；二級圖譜掃描時，活化時間為10ms，隔離寬度為2m/z；碎裂方式為誘導碰撞解離，歸一化碰撞能量設定為35％，動態排出時間為90s。

7.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)中，對質譜數據進行搜索的參數設置為：蛋白酶為胰蛋白酶，漏切位點設置為2，母離子質量偏差為10ppm，碎片離子的質量偏差為0.6Da，盲搜上限設為1000，盲搜下限設為-200，蛋白FDR為0.01；

選擇肽段分數>200和FDR<0.01的肽段作為Wildcard Search^TM搜索到的未知修飾數據，組成質量變化的范圍為-200Da-400Da的一維數據矩陣，再將數據按照1Da的變化范圍，0.5Da為界限，分割成601個數據窗口。

8.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)中，多變量高斯混合分布聚類分析的方法為：針對每一個數據窗口，用R語言中的mclust程序包做高斯混合分布聚類分析，根據BIC取最優值，再對每一個峰進行合并分析，然后用高斯分布擬合每一個峰，確定峰值；聚類之后的每個峰中所包含的肽段位點數據，根據位點氨基酸分布，選擇分布大于5％的數據作為一類非編碼氨基酸。