[發明專利]一種早期旱脅迫誘導高羊茅滯綠基因SGR基因的篩選試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201410254832.6
• 申請日: 2014-06-10
• 公開（公告）號: CN104328165A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 張志飛;王增裕;趙志麗;劉明稀;文昭竹
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;楊琦玲

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高羊茅SGR候選基因的篩選試劑盒及方法。

背景技術

滯綠(stay?green)是指植物在衰老過程中葉綠素不降解或降解不明顯的現象，其最顯著的特征是植株生育末期葉片保持綠色的時間較長，甚至完全不黃化。SGR基因在高等綠色植物中相繼被克隆出來。早期研究主要是通過經典定位法，即遺傳分析后，通過定位的染色體區域測序進行基因鑒定，再通過突變體互補驗證。這些新發現的SGR基因主要由核基因編碼并受衰老特異誘導表達，大多數來源于C型滯綠突變體，C型滯綠突變體的葉綠素降解功能因為遺傳變異而異常，其葉綠素含量可以長期維持不變，但是，在生理功能退化方面與野生型無異，如擬南芥的突變體nye-1，水稻的突變體sgr和nyc3，辣椒(Capsicum?annuum)的突變體cl，豌豆(Pisum?sativum)的突變體JI2775，番茄(Solanum?lycopersicon)的突變體gf，柑橘(Citrus?sinensis)的突變體nan，蒺藜苜蓿(Medicago?truncatula)的突變體sgr等。

已知的SGR蛋白結構中不包含任何已知的結構域，因此尚無法判斷SGR可能的作用途徑。不過可以明確的是，與水溶性葉綠素結合蛋白相比，SGR無法結合葉綠素，因此，SGR不是參與葉綠素代謝過程的酶。Park等通過研究水稻的sgr(stay?green)突變體發現了OsSGR基因，并且發現該突變體中Psll捕光-葉綠素(LHCⅡ-Chl)復合體有積累效應，推測SGR基因作用于LHC?II，是調控LHC?II復合體穩定性的關鍵因子。在植物發生衰老時，位于葉綠體的SGR結合并形成SGR-LHC?II復合體從而將LHCII-Chl復合體結構拆分，其他參與到葉綠體代謝途徑中的分解蛋白酶便能夠找到并結合到相應的亞基上進行下一步的降解活動。因此，就目前的研究推測，LHC?II-Chl復合體的解離是葉綠素降解途徑的前提，而SGR可能是參與LHCⅡ-Chl拆卸的候選蛋白質。

高羊茅(Festuca?arundinacea)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是我國目前使用量增長最快的草種，在我國廣泛栽培，是南方地區綠期最長的冷季型草坪。冷劑型草坪草在夏季的“休眠”現象是生產利用中的主要限制因素。人們在草坪草種選擇時更傾向于綠期長的草種。SGR突變體雖然不能延長植物的光合作用，但表型變化可以滿足人們對綠色期延長的追求，所以延長綠色期是所有草坪草選育的主要目標之一。目前僅有研究報道1個高羊茅滯綠基因SGR候選基因senescence-inducible?chloroplast?non-yellowing?protein1(GenBank:ADV57294.1)，高羊茅SGR的分子基礎和調節機制相關信息匱乏。

隨著高通量測序技術的迅猛發展，轉錄組分析方法已經從微陣列技術，SAGE及MPSS技術的低通量模式改變成RNA-seq的高通量模式。RNA-Seq(RNA序列分析技術即全轉錄組測序)，具有明顯的優勢，僅需要較少的RNA樣品，就可對某個物種或者特定細胞類型的整體轉錄活動進行檢測，更精確的揭示序列變化、基因表達的完整注釋、基因在樣品間的差異表達分析和檢測可變剪接等，使整個轉錄組以高通量和定量的方式加以調查。這些獨特的優勢，使得RNA-Seq技術成為目前深入研究生物體轉錄組復雜性的強大工具，也被認為是一種發現新基因的有效手段之一。

數字基因表達譜(Digital?Gene?Expression?Profiling，DGE)是利用高通量測序，系統、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態下的基因表達情況的技術。DGE已被廣泛應用于基礎科學研究領域。已有研究報道利用DGE對黃肉獼猴桃果實著色過程中相關差異基因、脂多糖活化巨噬細胞的基因表達、莖瘤芥根和莖組織轉錄組比較和小尾寒羊高繁性狀相關基因的篩選和解析研究。

本地Blast(Local?Basic?Local?Alignment?Search?Tool)是在本地化的蛋白質或DNA數據庫中進行相似性序列比較的工具，已經被用于某一物種特定組織中某一個或家族的基因篩選。已有研究報道利用擬南芥WRKY轉錄因子家族基因序列為探針，對蘋果全基因組序列執行本地Blast搜索，結合生物信息學方法來篩選蘋果WRKY轉錄因子家族基因；以擬南芥和水稻ANK家族基因序列執行本地Blast搜索‘金冠’蘋果全基因組序列，結合結構域搜索工具CD(conserved?donmain)、perl程序等生物信息學方法，解析蘋果錨蛋白基因ANK家族基因。

發明內容