[發明專利]一種早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201410254825.6
• 申請日: 2014-06-10
• 公開（公告）號: CN104004848A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 張志飛;張瑜;王增裕;陳桂華;趙志麗
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學;中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;楊琦玲

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒及方法。

背景技術

DREB2s(Dehydration?Responsive?Element?Binding?Protein2)是一類植物特有的轉錄因子，隸屬于AP2/EREBP轉錄因子家族，在植物逆境信號轉導途徑中有重要作用。Liu等和Kasuga等首次從擬南芥[Arabidopsis?thaliana(L.)Heynh.]中克隆得到了DREB2A轉錄因子，發現其與干旱應答元件CRT/DRE(C-Repeat/Dehydration-Responsive?Element，核心序列：A/GCCGAC)或GCC-BOX(核心序列：TAGCCGCCA)特異性結合，參與調控干旱、高鹽和低溫等耐性相關基因的表達，在植物的非生物脅迫應答過程中發揮重要作用。在GenBank數據庫注冊的編碼DREB2s序列涉及20多個物種，這其中包括模式植物、重要的大田作物和旱鹽脅迫生境條件下生長的植物，目前人們更熱衷于在逆境適應性強的植物材料中挖掘新的DREB2基因，DREB2s基因功能及調控機制的研究則主要以模式植物擬南芥為研究對象。DREB2s促使下游含DRE元件的脅迫誘導基因發揮作用，使植物的抗逆性得到綜合改良。Qin等將玉米ZmDREB2A轉化到擬南芥，發現其過量表達能夠激活下游HSPs和HsfA3等熱激相關基因的表達，轉ZmDREB2A植物的耐旱和耐熱性提高。PgDREB2A可以增加轉基因煙草的耐鹽和抗旱性，并且在滲透脅迫和熱脅迫條件可以上調下游基因，轉PgDREB2A煙草耐鹽性、抗熱性顯著提高，而T0代種子產量和植株表型與野生型無異。但是，植物中過量表達有些來源的DREB2s，在提高植株抗逆性的同時，會對植物產生一定的毒害作用，導致轉基因植物生長遲緩，影響植物的生長發育，表現為生長的延遲及植株的矮化。Sakuma等對轉基因植株生長遲緩原因研究時發現，使用誘導型啟動子RD29A可以避免AtDREB2A過量表達引起的生長遲緩。35S:AtDREB2A?CA轉基因植株生長矮化，而且矮化程度與AtDREB2A?CA和其下游功能基因RD29A的表達水平成正比，而轉全長基因的35S:AtDREB2A?FL轉基因植株的生長矮化現象不明顯。

高羊茅(Festuca?arundinacea＝Lolium?arundinaceum)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是我國目前使用量增長最快的草種，在我國大部分地區可以栽培，是南方地區綠期最長的冷季型草坪。高羊茅的夏季生長需水量較大，夏季干旱和高溫環境條件是限制其生長的主要因素。提高環境的適應性，培育節水、耐旱抗高溫型品種是目前高羊茅育種的主要目標之一。植物抗逆性狀非常復雜，往往與數量性狀位點連鎖，而高羊茅的遺傳背景復雜(PPG1G2G3G4，2n＝6x＝42)，基因組較大(5.27～5.83×10⁶kb)，且為種子繁殖為主的異花授粉植物，采用傳統的選擇育種獲得的品種(品系)多為異質雜合群體，選育周期長，性狀不穩定，獲得優良抗性品種十分困難。隨著植物分子生物學和基因工程技術的迅猛發展，利用基因工程技術改良高羊茅性狀成為可能。DREB2s轉錄因子可調控下游大量逆境脅迫基因的表達，利用該轉錄因子有望綜合改良植物的抗逆性。因此，對具有產業化潛力的DREB2轉錄因子進行基因功能和抗逆調控機制研究，利用它們改造高羊茅，將有助于高羊茅等草坪植物的抗逆基因工程育種。

與轉錄組學研究的方法(基因芯片技術、SAGE技術和MPSS技術、EST技術、高密度全基因組芯片)相比，RNA-Seq技術是全新的轉錄組研究方法，可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，用序列片段的數量表示基因的轉錄水平，能夠檢測可變剪接和新基因，對轉錄體結構的分析有了明顯的提高，而且不同批次樣品間基因表達的數據易于進行比較。這些獨特的優勢，使得RNA-Seq技術成為目前深入研究生物體轉錄組復雜性的強大工具。

利用RNA-seq技術系統分析高羊茅DREB2轉錄因子，為揭示高羊茅DREB2候選基因、剖析DREB2參與的植物抗逆調控分子網絡提供了新的思路，將加快FapDREB2在高羊茅和其他植物的抗逆基因工程育種的步伐。