[發(fā)明專利]一種從豆渣中制備高活性纖溶酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410249251.3
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104004740A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳非;趙城彬;孫楚;李秋;姚子鵬;周媛媛;劉瑤;董興葉;盛慧;劉金陽
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12R1/685;C12R1/69
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從豆渣中制備高活性纖溶酶的方法。

背景技術(shù)

血栓病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，是死亡威脅最大的疾病之一，隨著我國人口老齡化趨勢的發(fā)展，心腦血管疾病將會越來越多的威脅我們的健康，因此，研制高效的溶栓藥已成為臨床的迫切要求。在動物、植物、微生物中都發(fā)現(xiàn)了天然的溶栓物質(zhì)，而微生物是纖溶物質(zhì)的一種重要來源，目前在細(xì)菌、真菌、藻類中都發(fā)現(xiàn)了纖溶酶，其來源有：芽孢桿菌、鏈球菌、曲霉菌、松藻屬。目前，有關(guān)微生物產(chǎn)纖溶酶的研究幾乎全部是只采用一種微生物，而微生物混合培養(yǎng)在許多領(lǐng)域顯示出了無可比擬的優(yōu)勢，對其研究也日趨增多。但是目前關(guān)于微生物混合培養(yǎng)的研究，特別是利用混合培養(yǎng)產(chǎn)酶這一研究方向上，一般是基于篩選相容的菌株，然后進(jìn)行不同混合條件下產(chǎn)酶能力的檢測，關(guān)于其機(jī)制等方面的研究尚沒有相關(guān)報道。利用雙菌種混合培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的方法，具有重要意義。

超微粉碎是一種機(jī)械處理的物理方法，它是機(jī)械力學(xué)、電學(xué)、原子物理、膠體化學(xué)、化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)等交叉匯合的一門新興學(xué)科，是近20年迅速發(fā)展起來的一項新技術(shù)。物料經(jīng)超微粉碎后能有效改善粉體的顆粒粒度，且由于機(jī)械化學(xué)應(yīng)力的作用，可對某些天然生物資源的食用特性、理化性能和功能特性能產(chǎn)生多方面的影響。超微粉碎可以提高發(fā)酵、酶解過程的化學(xué)反應(yīng)速度，由于具有極大的比表面，經(jīng)過超微粉碎后的原料在生物、化學(xué)等反應(yīng)過程中，反應(yīng)接觸的面積明顯增加了，因而可以提高反應(yīng)速度，在生產(chǎn)中節(jié)約了時間，提高了生產(chǎn)效率。

超聲在食品工業(yè)中的作用日顯突出，如加工，保鮮和提取等方面。超聲改性屬于物理改性方法的一種，與化學(xué)改性相比其具有副產(chǎn)物少，可操作性強(qiáng)的優(yōu)點。同樣的完整再現(xiàn)的食品加工過程，現(xiàn)在可以通過使用超聲波在幾秒或幾分鐘內(nèi)以高的完成再現(xiàn)性，不但可以降低處理成本，簡化操作，而且僅消耗小部分就能給出更高的最終產(chǎn)品的純度。此外，超聲波具有熱作用、機(jī)械作用、空化作用以及許多次級效應(yīng)如擊碎、乳化、擴(kuò)散等，能有效地打破細(xì)胞邊界層，使擴(kuò)散速度增加，促進(jìn)固體物料中有效成分的溶出，可顯著地提高提取效率。

目前國內(nèi)對纖溶酶的生產(chǎn)已經(jīng)做了一定的研究，并且申請了專利：如申請?zhí)枮?361280A的專利提供了一種新的纖溶酶-蚯蚓纖溶酶Z，編碼蚯蚓纖溶酶Z的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蚯蚓纖溶酶Z的方法。申請?zhí)?01730740A的專利提供生產(chǎn)正確折疊的重組纖溶酶原和纖溶酶多肽的方法。申請?zhí)枮?01918548A的專利本發(fā)明提供了涉及重組修飾的纖溶酶(原)分子的多聚核苷酸和多肽。纖溶酶(原)分子具有位于天然人纖溶酶原分子中的激活位點N-末端的單個三環(huán)域，其如此組合使得不存在外來序列，并顯示賴氨酸-結(jié)合以及與天然酶相關(guān)的顯著的酶特征。以上方法均對纖溶酶進(jìn)行了一定的研究與改善，但都是對現(xiàn)有的纖溶酶進(jìn)行重組，本發(fā)明提供一種新的纖溶酶制備方法，生產(chǎn)工藝簡單方便，且纖溶酶活性高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從豆渣中制備高活性纖溶酶的方法，為臨床上溶栓藥物提供新的可能。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種從豆渣中制備高活性纖溶酶的方法，該方法包括以下步驟：(1)將豆渣干燥后用QLM扁平式超音速氣流粉碎系統(tǒng)進(jìn)行超微粉碎，所述的進(jìn)料氣流為0.6MPa，粉碎氣流為0.6MPa；(2)將超微粉碎后的豆渣進(jìn)行水分調(diào)節(jié)，然后進(jìn)行滅菌，冷卻后接入黑曲霉與米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵得發(fā)酵產(chǎn)物，所述的黑曲霉接種量為豆渣質(zhì)量的6％，米曲霉接種量為豆渣質(zhì)量的8％，發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵pH為7.5，發(fā)酵時間為10-40h；(3)將發(fā)酵產(chǎn)物分散于生理鹽水中進(jìn)行超聲輔助浸提，所述的超聲功率為20-100W，浸提溫度為20-40℃，浸提時間為1-5h，浸提后離心分離得上清液；(4)將上清液進(jìn)行硫酸銨鹽析，所述的硫酸銨飽和度為30-80％，鹽析后進(jìn)行透析濃縮、DEAE-Sepharose?FastFlow陰離子交換層析和Sephadex?G-75凝膠過濾層析，層析后進(jìn)行真空濃縮、冷凍干燥即得纖溶酶。

所述的優(yōu)選發(fā)酵時間為30h。

所述的超聲輔助浸提優(yōu)選參數(shù)為：超聲功率60W，浸提溫度30℃，浸提時間3h。

所述的優(yōu)選硫酸銨飽和度為60％。