[發明專利]烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應用

有效

• 申請號: 201410245359.5
• 申請日: 2014-06-04
• 公開（公告）號: CN104087570B
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 李榮杰;尚海濤;楊為華;鄧遠德;徐斌;楊金環
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P7/48;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明提供一種烏頭酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。編碼該突變體的基因序列如SEQ ID No.2所示。本發明通過基因工程方法使黑曲霉中烏頭酸酶編碼基因突變，降低其酶活力，經計算，烏頭酸酶突變體的酶活力與野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理論上可提高檸檬酸的產量和/或產率。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應用。

背景技術

檸檬酸，又名枸櫞酸，化學名稱是2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸。因其具有令人愉悅的酸味，人口爽快，無后酸味，安全無毒，已成為當前世界上生產量和消費量最大的食用有機酸。世界上檸檬酸行業的集約化程度非常高，生產重心已轉移至中國，我國檸檬酸產量和出口量已連續多年居世界第一。2008年，我國檸檬酸產能達到10萬噸，占世界總量的70％左右，其中70-80％用于生產飲料、食品，其余用于醫藥、化工、環保、化妝品、紡織、印染、建筑等各個領域。

黑曲霉(Aspergillus niger)是生產檸檬酸最常見的菌株，已有報道稱黑曲霉在發酵生產檸檬酸過程中存在三羧酸循環的酶系，其中由檸檬酸到異檸檬酸，即檸檬酸→順烏頭酸→異檸檬酸，兩步反應均由烏頭酸酶(aconitase，ACO)催化。因此阻斷檸檬酸向下的代謝是檸檬酸的積累關鍵，即阻斷烏頭酸酶的催化反應。通過基因工程方法使黑曲霉中烏頭酸酶編碼基因突變，降低其酶活力，理論上可提高檸檬酸的產量和/或產率。

發明內容

本發明的目的是提供一種烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應用。

為了實現本發明目的，本發明的烏頭酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

與野生型的烏頭酸酶(野生型烏頭酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ IDNo.3和4所示)相比，本發明的烏頭酸酶突變體具體的氨基酸序列的改變是：M226V(第226位甲硫氨酸變為纈氨酸)，N227Y(第227位天冬酰胺變為酪氨酸)，T376N(第376位蘇氨酸變為天冬酰胺)，A377T(第377位丙氨酸變為蘇氨酸)，S529P(第529位絲氨酸變為脯氨酸)，I530M(第530位異亮氨酸變為甲硫氨酸)，H580R(第580位組氨酸變為精氨酸)。

本發明還提供編碼所述烏頭酸酶突變體的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

本發明還提供含有編碼所述烏頭酸酶突變體基因的載體、。

本發明還提供含有編碼所述烏頭酸酶突變體基因、或上述載體的轉基因細胞系及工程菌。

本發明還提供編碼所述烏頭酸酶突變體的基因在提高發酵生產檸檬酸產量中的應用。

本發明還提供用于PCR特異性擴增編碼所述烏頭酸酶突變體的基因的引物對，所述引物對為：

正向引物：5′-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3′

反向引物：5′-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3′。

本發明進一步提供所述烏頭酸酶突變體的構建方法，包括以下步驟：

(1)從黑曲霉(Aspergillus niger)基因組DNA中，擴增ACO的編碼基因aco；

(2)采用易錯PCR技術，以ACO的編碼基因aco為模板，擴增獲得ACO突變體基因；

(3)將步驟(2)所得易錯PCR產物及表達質粒pET28a(+)用Sac I和Not I雙酶切后連接，連接產物轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂布至含Kan的LB平板，將平板置37℃恒溫培養箱培養，即得構建得到重組ACO基因突變庫；