[發明專利]一種環糊精糖基轉移酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410236224.2
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104017784A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發明（設計）人: 邢將軍
• 申請（專利權）人: 江蘇誠信制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P19/60
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 章鳴玉

技術領域

本發明屬于基因工程與酶工程領域，涉及一種用于以β-環糊精、維生素C為底物合成AA-2G的環糊精糖基轉移酶及其變體，具體為衍生自Thermoanaerobacteriumxylanolyticum?LX-11的CGT酶(cyclomaltodextringlucanotransferase)的環糊精糖基轉移酶及其變體。

背景技術

維生素C是一種人體不能自身合成的水溶性維生素，在體內發揮重要的生理作用。然而，由于還原性強所導致的極不穩定性，使得其應用受到很大限制，因此，上世紀以來，開發既能保證維生素C的正常生理功能又具有較好穩定性的維生素C衍生物稱為研究熱點。

2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)為維生素C的糖類衍生物，因具有以下優點成為維生素C的最佳替代品：1)良好的非還原活性，在水溶液中穩定；2)良好的耐熱性和耐光性；3)在胞內水解生產維生素C和葡萄糖，具有與維生素C同等的生物活性。

目前，在糖基轉移酶催化下將供體上的葡萄糖苷轉移到維生素C的2位C上是合成AA-2G的唯一途徑。已經開發的用于合成AA-2G的酶有5種，其中環糊精糖基轉移酶(CGT酶)因其底物特異性特別強稱為合成AA-2G中使用最廣泛的酶源。

環糊精糖基轉移酶(CGT酶)是一個多功能型酶，能夠催化包括環化反應、歧化反應、偶合反應以及水解反應在內的多種反應。通過偶合和歧化反應，CGT酶能夠催化供體如淀粉或環糊精上的低聚糖轉移至受體分子例如維生素C，顯著提高受體分子的功能性、水溶性和穩定性。

現有技術中使用CGT酶生產AA-2G的主要問題在于：1)酶的熱穩定性和貯存穩定性較差，不適合AA-2G的生產；2)轉化率不高，較低的產量限制了AA-2G的大規模生產。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種環糊精糖基轉移酶及其制備方法和應用，使環糊精糖基轉移酶熱穩定性和貯存穩定性更好，活性高，將該酶應用于生產AA-2G，提高產率，提高維生素C轉化率，使該環糊精糖基轉移酶適合AA-2G的大規模生產。

本發明的技術解決方案如下：

一種環糊精糖基轉移酶，所述環糊精糖基轉移酶為SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位有1-5個的氨基酸殘基置換的突變體。

所述突變為將55位的甘氨酸置換為丙氨酸、77位的苯丙氨酸置換為亮氨酸、121位的甘氨酸置換為纈氨酸、331位的亮氨酸置換為異亮氨酸、543位的蘇氨酸置換為酪氨酸、604位的天冬酰胺置換為甘氨酸以及615位的苯丙氨酸置換為丙氨酸。

SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列為Thermoanaerobacteriumxylanolyticum?LX-11菌株的CGT酶的氨基酸序列。

根據本發明所述的環糊精糖基轉移酶，優選的是，所述環糊精糖基轉移酶為SEQ?ID?NO:4、6、8、10、12、14、16、18所示的氨基酸序列。

根據本發明所述的環糊精糖基轉移酶，進一步優選的是，所述環糊精糖基轉移酶為SEQ?ID?NO:4所示的氨基酸序列。

本發明還提供一種編碼所述環糊精糖基轉移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ?ID?NO:3、5、7、9、11、13、15、17所示。

本發明還提供一種編碼所述環糊精糖基轉移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ?ID?NO:3所示。

本發明還提供一種制備所述環糊精糖基轉移酶的方法，包括如下步驟：提取和擴增編碼野生型CGT酶的DNA序列，利用易錯PCR、定向進化技術建立突變文庫，經篩選，獲得所述新型環糊精糖基轉移酶。

本發明還提供一種所述環糊精糖基轉移酶在制備2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應用。

根據本發明所述環糊精糖基轉移酶在制備2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應用，所述在制備2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應用為將β-環糊精與抗壞血酸溶于水中，調節pH為5-7，加入所述新型環糊精糖基轉移酶，在溫度30-60℃反應，終止反應，經分離純化得到2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸。

所述在制備2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應用中將β-環糊精與抗壞血酸溶于水中，優選調節pH為5.5-6.0。

所述在制備2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸上的應用中，優選反應溫度37-55℃。