[發(fā)明專利]燒土火絲菌天然抗菌肽及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711248627.9
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN108148123B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王建華;楊娜;毛若雨;王秀敏;滕達;郝婭;王瀟
• 申請（專利權(quán)）人: 北京生泰云科技有限公司
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C12N15/31;C12N1/19;A23L33/18;A23K20/147;A61K38/16;A61P31/04;A61K8/64;A61Q19/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明公開了一組燒土火絲菌天然抗菌肽，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:5?8所示。通過檢索真菌蛋白數(shù)據(jù)庫，篩選分析獲得抗菌肽成熟肽序列，通過對比分析，該組天然抗菌肽與目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明顯差異，屬于新型抗菌肽。該組抗菌肽經(jīng)密碼子優(yōu)化后實現(xiàn)其在畢赤酵母中的重組表達。抗菌實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的抗菌肽對革蘭氏陽性菌，尤其是金黃色葡萄球菌ATCC43300，豬鏈球菌CVCC 3928，CVCC 606具有顯著抑菌活性，可應(yīng)用于抗菌藥物、食品添加劑、化妝品、飼料添加劑、防腐劑等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用價值和市場前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，，具體地說，涉及燒土火絲菌天然抗菌肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗生素對感染性疾病的治療發(fā)揮了重要作用，但由于抗生素濫用，耐藥菌株不斷增加，現(xiàn)已出現(xiàn)多種超級細菌，病原菌耐藥性問題已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為未來人類健康面臨的主要威脅和挑戰(zhàn)之一。金黃色葡萄球菌是人類重要病原菌，常引起食物中毒和傷口感染，在動物養(yǎng)殖業(yè)中主要引起牛、羊的乳房炎。原料奶中金黃色葡萄球菌易產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素等有害物質(zhì)而污染乳制品(等，EnterotoxigenicStaphylococcus aureus in bulk milk in Norway.Journal of AppliedMicrobiology.2005,99:158-166.)，影響乳制品的質(zhì)量安全，同時對消費者帶來安全隱患。耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA、VRSA等)能在畜禽和人之間實現(xiàn)交叉感染，很多引起人類感染的MRSA菌株最終發(fā)現(xiàn)均來源于動物體內(nèi)。另外，有研究表明，耐藥性金黃色葡萄球菌能在畜禽和人之間實現(xiàn)交叉感染，很多引起人類感染的MRSA菌株最終發(fā)現(xiàn)均來源于動物體內(nèi)。因而尋找新型抗菌物質(zhì)取代或輔助傳統(tǒng)抗生素以應(yīng)對細菌耐藥性問題至關(guān)重要。

抗菌肽(antimicrobial peptide)是廣泛存在于生物體內(nèi)具有抗菌活性的多肽，形成生物體第一道先天防御系統(tǒng)，對細菌、真菌、病毒和原蟲等均具有殺滅作用。在諸多的抗菌肽中，真菌防御素的研究正逐漸受到關(guān)注。真菌防御素對革蘭氏陽性細菌具有獨特高效的殺菌作用，與傳統(tǒng)抗生素之間不存在交叉耐受性，且對人的細胞沒有毒害作用。真菌防御素易于通過基因表達進行大量生產(chǎn)，解決了抗菌肽生產(chǎn)成本高的問題。然而，現(xiàn)存的抗菌肽中，僅有0.46％來自真菌。因此，尋找真菌中天然抗菌肽并進行制備是本發(fā)明研究的重要內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供燒土火絲菌天然抗菌肽及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的燒土火絲菌天然抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽選自氨基酸序列分別如SEQ ID NO:5-8所示的多肽P1-P4中的任一個。

本發(fā)明還提供上述抗菌肽的編碼基因，多肽P1-P4編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:9-12所示。

本發(fā)明還提供表達盒、表達載體、克隆載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或工程菌，其包括包含編碼所述抗菌肽基因序列的核酸。

本發(fā)明還提供一種重組畢赤酵母，其是用攜帶有所述抗菌肽編碼基因的表達載體(例如pPICZαA)轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌，篩選陽性克隆得到的。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述重組畢赤酵母的構(gòu)建如下：所述抗菌肽的編碼基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后，在優(yōu)化后的基因序列(分別如SEQ ID NO:9-12所示)的5’端添加XhoI酶切位點和Kex2切割位點，在3’端添加TAA和TAG終止子序列以及XbaI酶切位點，得到基因構(gòu)建物，再將所述基因構(gòu)建物插入載體pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位點之間構(gòu)建得到重組表達載體，最后用所述重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌X-33，篩選陽性克隆。

本發(fā)明還提供利用所述重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)天然抗菌肽的方法，其是將上述的重組畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生抗菌肽。

本發(fā)明還提供所述抗菌肽在制備廣譜抗菌藥物或組合物中的應(yīng)用。