[發明專利]一種食品及飼料中狐貍源成分檢測側向流試紙條檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410233590.2
• 申請日: 2014-05-29
• 公開（公告）號: CN104017872B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 鄭文杰;趙良娟;趙衛東;崔穎;張宏偉;劉培;蔡國瑞;高旗利;尹長城
• 申請（專利權）人: 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學和免疫學領域，食品及飼料中狐貍源DNA的PCR核酸擴增，及側向流免疫膠體金試紙條試劑盒的制備和應用方法。?

背景技術

為防止牛海綿狀腦病(?bovine?spongiform?encephalopathy,?BSE?)經添加在動物飼料中的牛肉、牛骨傳播，1994年歐盟和1997年美國分別在1994年和1997年制定禁止在反芻動物的飼料中添加反芻動物源性蛋白的法規，2000年歐盟將這項禁令擴大到禁止向用于食用的動物飼喂加工過的哺乳動物、鳥類和魚類蛋白成分。我國農業部于2004年頒布的《動物源性飼料產品安全衛生管理辦法》中規定禁止在反芻動物飼料中使用動物源性飼料產品(乳及乳制品除外)，但在動物飼料中人為摻入反芻動物（主要是牛、羊）肉和骨制品的現象時有發生。?

近年來，國內外食品市場上假羊肉、假牛肉等以假亂真現象層出不窮，動物源性食品摻雜摻假等各種食品安全事件的頻發越來越讓老百姓心驚膽顫。2013年初，歐洲的“馬肉風波”愈演愈烈，使得消費者“聞馬色變”。之后歐美的”魚肉風波”又再一次拉響了食品安全的警鐘。要保證食品及飼料的安全，需要靈敏、便捷、準確的檢測方法提供基礎。?

傳統的食品及飼料中動物性成分鑒定主要通過顯微鏡檢、基于蛋白質檢測的免疫學方法以及基于核酸檢測的各類PCR方法，近年還發展了近紅外檢測法(NIRS)。食品及飼料成分中摻入的各種動物源成分在高溫處理和加工過程中易于受到破壞，不同種屬動物的蛋白質序列之間差異不大，難以區別，發明專利“SDS-PAGE?法鑒別肉及肉制品中動物源性成份”（公開號：CN?102213720?A）提供了一種以蛋白質的SDS-PAGE電泳方式鑒定豬、牛、羊、鵝、魚的動物蛋白的方法，但不同來源和處理方式的蛋白電泳譜帶不同，帶來結果判別的障礙，對于飼料中的動物成分更難以實施。?

因為基因編碼序列的簡并性特征和非編碼序列的存在，核酸成為較蛋白更易檢出差異的靶分子，特別是線粒體DNA，拷貝數高，存在物種間差異，對其差異片段的分析是主要的鑒定方法，這類方法因靈敏度高，特異性好，耗時少而發展迅速，主要的方法包括普通/熒光PCR方法及基因芯片技術。在以線粒體DNA序列進行物種的種屬鑒別時，常用的區域包括編碼細胞色素B的Cytochrome?b基因（cytB）、核糖體小亞基12S?RNA編碼序列（12S?ribosomal?RNA）、細胞色素C亞基I（cytochrome?C?oxidase?subunit?I）的編碼基因coxI、編碼ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制區D-loop片段。這些區域的序列變異適中，即在種內有一定的保守性，又體現出一定的種間差異。?

熒光定量PCR技術是一種高靈敏度核酸檢測和定量方法，基本原理是在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。熒光定量PCR技術使定性檢測邁上了可以量化的臺階，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性，具有實時性和準確性等特點，特別是依賴探針結合的TaqMan方法，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。?在物種鑒定應用方面，國內已經發布的國家標準或行業標準涵蓋了鵝、羊、鹿、駱駝、馬、驢、豬、兔、狗和魚等哺乳動物或水生生物。發明專利“用于檢測食品和飼料中狐貍成分的引物和探針”（公開號：CN103060435A）描述了一種能本發明選取狐貍的線粒體細胞色素C氧化還原酶I亞單位基因序列，設計一組特異性引物和探針，使用該引物和探針，采用實時熒光PCR技術，可快速、靈敏、特異地檢測食品和飼料中的狐貍成分，公開號為CN103088116A的發明專利“食品和飼料中狐貍成分快速檢測試劑盒的制備和檢測方法”以用實時熒光PCR技術檢測食品和飼料中狐貍成分的試劑盒及方法，主要目的是防止以其他動物源制品替代狐貍源成分。出于此種目的檢測方法，比如，檢測方法公開號為CN103361422A的發明“一種鑒別摻假肉及其制品的多重PCR快速檢測方法”涉及一種多重PCR快速檢測技術快速檢測肉品中是否含有某種被測定肉的技術。上述方法均為常規的PCR方法，需要對產物凝膠電泳后進行圖像采集和分析，耗費時間較長，且難以保證檢測的靈敏度。?