[發明專利]綠盲蝽超氣門蛋白特異性多克隆抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410229553.4
• 申請日: 2014-05-27
• 公開（公告）號: CN103992404A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 譚永安;肖留斌;柏立新;孫洋;趙靜
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王云

技術領域

本發明涉及抗體工程農業科學技術領域，具體涉及綠盲蝽超氣門蛋白特異性多克隆抗體及其制備方法和應用。

背景技術

綠盲蝽Apolygus?lucorum(Hemiptera:Miridae)屬半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果樹、牧草等多種農作物上的重要害蟲。近年來，由于轉Bt基因棉的大面積種植和農業產業結構的調整等原因，綠盲蝽種群數量急劇上升，加之長期依賴化學農藥防治，致使綠盲蝽的抗藥性日漸增強，目前農業生產上的綠盲蝽防控面臨嚴峻挑戰，急待開拓減少化學農藥使用的新型無公害防控手段。迄今，多種新型昆蟲生長調節劑已應用到防治綠盲蝽的危害中，如氟鈴脲等第三代殺蟲劑，顯示出較好的殺蟲效果。但是，由于這些農藥的特異性靶標表達量的差異，可顯著影響其藥效。超氣門蛋白(ultraspiracle?protein，USP)就是多種昆蟲生長調節劑的靶標基因，也是綠盲蝽體內一種重要的核基因。綠盲蝽USP基因在不同齡期、不同組織中的蛋白表達量均不相同，導致昆蟲生長調節劑施用后，對靶標基因超氣門蛋白的抑制效果出現較大差異，從而可引起農藥的使用效果下降。因此要求有靈敏度高，特異性好的蛋白檢測技術來分析綠盲蝽體內超氣門蛋白的表達量，指導這些昆蟲生長調節劑的使用時間。目前，應用在昆蟲蛋白檢測的方法主要有ELLSA和Western?blot。

發明內容

發明目的：本發明的第一個目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體。

本發明的另一個目的在于提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的制備方法。

本發明的又一個目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的ELLSA檢測方法。

本發明的又一個目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的Western?blot檢測方法。

本發明的又一目的是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的抗體特異性檢測方法。

技術方案：為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體，將重組ALUSP蛋白免疫家兔后制得。

一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

a、抗原處理：取純化后的重組ALUSP蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化得到首次免疫抗原；弗氏不完全佐劑和重組ALUSP蛋白等體積混合得到第二、三和四次免疫抗原；

b、動物免疫：采用皮下多點注射法免疫健康的家兔，共免疫4次；首次免疫采用首次免疫抗原；間隔21天后第二次免疫采用第二次免疫抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測抗血清效價；間隔35天后第三次免疫采用第三次免疫抗原，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測抗血清效價；間隔49天后第四次免疫采用第四次免疫抗原，末次免疫后第7天，耳靜脈采血1ml，ELISA檢測抗血清效價；最后于第四次免疫后第8天，頸動脈采全血，分離血清，抗原親和純化法獲得綠盲蝽ALUSP多克隆抗體。

其中，上述步驟b中的首次免疫抗原劑量為0.3mg/只，第二、三和四次免疫抗原劑量為0.15mg/只。

本發明中采用的重組ALUSP蛋白為專利申請號為201410017156.0，發明名稱為“一種綠盲蝽超氣門蛋白、其編碼序列、載體和菌株”中的制備方法制備得到的重組ALUSP蛋白。

一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的ELISA檢測方法，包括以下步驟：用碳酸鹽包被重組ALUSP蛋白抗原，4℃孵育過夜，取出抗原后用PBST洗滌液洗滌三次，然后加入封閉液，取出再用PBST洗滌液洗滌三次，將一抗(兔子血清)首先按照1:1000稀釋，然后倍比稀釋，37℃孵育1小時；取出用PBST洗滌液洗滌三次，加入二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L))，1:8000稀釋，37℃孵育45min；取出用PBST洗滌液洗滌五次，3分鐘/次，最后加入底物溶液100μl/孔，反應15min，加入100μl2mol/L硫酸終止反應，在450nm波長下測定OD值，評價抗體效價。

一種綠盲蝽ALUSP多克隆抗體的Western?blot檢測方法，包括以下步驟：取ALUSP重組蛋白按梯度上樣。上樣完畢后，聚丙烯酰胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V直到電泳結束。電泳結束后，取下凝膠進行轉膜，恒壓100V轉膜1.5小時。電轉結束后，取下膜后先用PBS洗滌4次，每次5分鐘。然后置于37℃，5％脫脂奶粉封閉液中封閉1小時。用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中37℃反應1小時。洗膜4次，每次5分鐘，用含5％牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應1小時。洗膜ECL顯影。