[發明專利]高靈敏拉曼光譜檢測DNA的一種方法

無效

• 申請號: 201210232538.6
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN103529011A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 鞠熀先;高豐雷;朱珠;雷建平
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明為一種高靈敏拉曼光譜檢測DNA的方法。它通過磁珠表面上的鏈替代聚合和銀增強作用進行雙重信號放大，利用外磁場分離磁珠上的鏈替代產物，用拉曼光譜進行高靈敏DNA檢測。

二、背景技術

DNA是遺傳信息的承擔者，DNA分子中堿基序列的變異與人類許多遺傳疾病有關。因此，對特定序列的DNA進行分析并進行堿基突變的檢測在基因篩選、遺傳疾病的早期診斷等方面具有深遠的意義。DNA雜交是核酸濃度檢測和結構分析的重要手段。DNA雜交檢測技術包括熒光、化學發光、電化學和表面等離子共振等，其中熒光分析技術可以進行多種DNA的同時檢測。但自身的光猝滅、復雜的操作和不同信號的光譜重疊限制了熒光分析技術的應用。雖然半導體量子點有相對窄的光譜帶，其自身的毒性也是一個廣泛關注的問題。因此需要發展新穎的分析技術。

表面增強拉曼光譜檢測技術可以彌補熒光檢測技術的缺陷。由于其很窄的光譜帶、低的光猝滅和自身猝滅，拉曼光譜檢測DNA的方法已得到發展。其中之一是利用眾所周知的金納米顆粒進行固定。這一過程需要很長的溫育時間、重復的洗滌步驟，并要克服干擾物的非特性吸附。因此本發明建立了一種簡便、靈敏的DNA拉曼光譜檢測方法。

三、發明內容

本發明的目的是：以磁性納米顆粒為基底固定識別探針分子信標，通過分子信標探針與目標DNA分子，并隨后與引物修飾的拉曼染料-銀納米復合物的雜交將納米復合物連到磁性納米顆粒上，利用鏈替代聚合和銀增強作用實現雙信號放大，建立一種不需要清洗步驟的檢測DNA的靈敏方法。

本發明通過以下技術方案來實現：

將目標DNA分子與固定在磁珠表面的分子信標探針進行雜交，打開分子信標環，加入引物修飾的拉曼染料-銀納米復合物，通過引物與分子信標莖端的雜交將復合物連接到磁珠上，在聚合酶與dNTP存在下誘導DNA鏈發生聚合反應而釋放目標DNA分子，被釋放的目標DNA分子與固定在另一個磁珠上的分子信標雜交，產生另一個聚合循環。在循環鏈替代聚合完成后，利用磁珠分離鏈替代產物，并在產物連接的納米復合物表面沉積一層銀納米殼層，增強染料的拉曼信號。檢測標準DNA溶液與樣品獲得的拉曼信號，進行DNA濃度檢測與單堿基錯配的判別。

上述的識別探針通過羧基與氨基的共價鍵合將一端帶有氨基的分子信標固定在羧基功能化的磁性納米顆粒上而獲得；引物修飾的拉曼染料-銀納米復合物可由帶有巰基的引物與拉曼染料在銀納米顆粒上的組裝制得。

DNA的高靈敏拉曼光譜檢測涉及磁珠表面上的鏈替代聚合和銀增強作用進行雙重信號放大(圖1)，其具體步驟如下：

1)通過羧基與氨基的共價鍵將一端帶有氨基的分子信標固定在羧基功能化的磁性納米顆粒上，獲得識別探針。同時將帶有巰基的引物組裝在銀納米顆粒上，進一步組裝帶巰基的拉曼染料，制得引物修飾的拉曼染料-銀納米復合物。

2)將目標DNA分子與識別探針混合，在磁珠表面進行雜交后，打開分子信標環，引物修飾的拉曼染料-銀納米復合物與分子信標莖端進行雜交，在聚合酶與dNTP存在下，在磁珠表面誘導DNA鏈聚合反應，并釋放目標DNA分子，發生循環鏈替代聚合，實現第一次信號放大。

3)在外加磁場的作用下將鏈替代聚合的產物從混合物中分離出來，與銀增強溶液混合，在銀納米顆粒外圍沉積一層銀殼，以增加拉曼染料的信號強度，獲得第二次信號放大。

4)檢測被增強的拉曼染料信號，利用DNA的標準溶液獲得檢測的工作曲線，從工作曲線進行DNA的分析。

本方法檢測DNA的原理：

通過目標DNA與固定在磁性納米顆粒表面的分子信標雜交，打開分子信標，讓分子信標的莖端與組裝在拉曼染料-銀納米復合物上的引物結合，引發DNA鏈發生聚合反應而釋放目標DNA分子，產生循環鏈替代聚合信號放大。在分離鏈替代產物后，在納米復合物表面沉積一層銀納米殼層，進一步放大染料的拉曼信號，利用被增強的拉曼信號進行DNA濃度檢測與單堿基錯配的判別。

本發明與現有技術相比，具有以下特點：

本發明用制備的拉曼染料-銀納米復合物為示蹤探針，利用雙重信號放大，通過拉曼光譜檢測，建立了一種高靈敏的拉曼光譜檢測DNA的方法。相對于現有的檢測方法，有以下特點：

(1)通過拉曼光譜檢測，操作簡單。

(2)拉曼光譜檢測在磁性納米顆粒上進行，不需要重復的洗滌步驟，并且磁性納米粒子價格低廉。

(3)設計了一種拉曼染料-銀納米復合物為示蹤標記探針，可通過銀增強作用進行拉曼信號放大。