[發明專利]基于全血培養法處理魚類染色體技術所用全血的方法

在審

• 申請號: 201410215094.4
• 申請日: 2014-05-21
• 公開（公告）號: CN103992984A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發明（設計）人: 曹麗萍;丁煒東;殷國俊;杜金梁;賈睿;劉英娟;王家豪
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;曹翠珍

技術領域

????本發明屬于細胞遺傳學技術領域，具體涉及一種基于全血培養法處理魚類染色體技術所用全血的方法。

背景技術

????染色體核型分析是魚類細胞遺傳學研究的重要內容之一，不僅對認識魚類的分類系統、進化關系及染色體演化過程具有顯著意義，還可為魚類種質研究及種群鑒定提供細胞遺傳學依據。目前魚類染色體的制作方法最常用的有活體注射法和細胞培養法等。其中，PHA活體注射法，在野外沒有良好設備的情況下，此法尤為適用，但這種方法要求剖殺魚，不利于魚種的保存，尤其是對稀有魚類和種魚不太合適。魚類外周血中的淋巴細胞在一定PHA濃度的刺激下，可迅速分裂增殖，適合進行染色體的研究。利用微量的外周血進行體外培養來制備染色體可有效解決上述問題，不同魚類，制片過程、觀察方法都不盡相同。

細胞培養法由于魚類的種屬特性、制片季節、PHA質量及操作者的經驗等方面的差異，得到的中期分裂相的數量和質量極不穩定。為了降低試驗成本，染色體的制備通常使用國產PHA，因未經純化，具有不同程度的紅細胞凝結性，尤其是某些魚種，血液中紅細胞含量豐富，對PHA的促凝效果很敏感，極易造成培養樣本的凝集，導致培養失敗；此外，染色體制備常用的抗凝劑肝素由于其制劑的純度高低以及其保存時間長短不等，其抗凝效果也不相同，量大可能引起溶血、抑制淋巴細胞的轉化和分裂，量少會發生凝血或培養物中出現纖維蛋白形成的膜狀結構，均會影響淋巴細胞轉化效率甚至試驗失敗。因此，每種魚類成熟的染色體制備條件需要不斷摸索和反復試驗才能建立，其中，全血樣本的處理至關重要。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于全血培養法處理魚類染色體技術所用全血的方法，該方法能成功有效的分離出淋巴細胞，排除紅細胞干擾，提高制備成功率，為保證試驗結果奠定基礎。

基于全血培養法處理魚類染色體技術所用全血的方法，包括以下步驟：

步驟1，將試驗魚麻醉，采血，將所得血液與ACD抗凝劑混合，得混合血液；

步驟2，將步驟1所得混合血液與第一培養基混合，得混合液；

第一培養基為0.1%?FCS-L-15培養基；

步驟3，將步驟2所得混合液加至體積百分數55～65的?Percoll分離液上，離心，去掉上層血漿，得到血漿層與分離液層交界處的淋巴細胞；

步驟4，將步驟3所得淋巴細胞加入第二培養基中，充分混勻，離心洗滌，得到細胞沉淀物；

二培養基為0.1%?FCS-L-15培養基；

步驟5，將步驟4所得細胞沉淀物轉至第三培養基中，20～30℃培養72～96h；

第三培養基為L-15培養基。

作為上述發明的進一步改進，所述步驟2中混合血液與培養基的容積比為1:1～1:2。

作為上述發明的進一步改進，所述步驟3中混合液與Percoll分離液的容積比為1:1～3:1。

作為上述發明的進一步改進，所述步驟3中離心條件為350g、18～25℃離心15～30min。

作為上述發明的進一步改進，所述步驟4中淋巴細胞與第二培養基的體積比為1:4～1:5。

作為上述發明的進一步改進，所述步驟4中離心條件為4℃、140g離心10min。

各步驟中的培養基可以根據本領域的相關技術知識進行常規選擇，本發明所述的“第一、第二、第三”不構成對培養基的種類是否相同的限定，只是用于描述培養基的使用次序。

影響獲取大量魚類淋巴細胞的因素很多，足量的外周血液的收集、離心力、離心時間、環境溫度、個體差異、血液黏稠度、魚的進化程度等都會影響分離的淋巴細胞數量和純度，但是，選擇最佳質量濃度的細胞分離液是影響淋巴細胞有效分離的關鍵因素。本發明中所使用的Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，不能穿透生物膜，對細胞無毒害；滲透壓低（＜20mo?sm/kg?H₂O）、粘度小、可形成高達1.3g/ml的密度；此外，其擴散常數低，所形成的梯度十分穩定，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力（200-1000g）于幾分鐘至數十分鐘內達到滿意的分離效果。分離不同種屬外周血中的淋巴細胞要求使用不同質量濃度的分離液，魚類外周血淋巴細胞質量濃度在1.085～1.075g/ml之間，根據Percoll的濃度配置出55%～65%密度的離心液，當Percoll濃度＜55%或＞65%時，將無法收集到淋巴細胞；同時環境溫度控制在18～25℃，可以保證細胞的存活率及最大的細胞分離液的分離效果；血液經過一定比例的稀釋可以降低血液自身黏稠度和紅細胞的聚集，提高淋巴細胞收獲量。