[發明專利]用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑及其制作方法

有效

• 申請號: 201410214857.3
• 申請日: 2014-05-20
• 公開（公告）號: CN103981136B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 楊春華;劉剛;賈露潔;李達旭;劉琳;郭麗娟;王目森
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23K30/18;A23K10/18;C12R1/25;C12R1/01
• 代理公司: 成都點睛專利代理事務所(普通合伙) 51232
• 代理人: 葛啟函

技術領域

本發明屬于青貯領域，具體涉及一種用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑及其制作方法。

背景技術

青貯是通過乳酸菌的增殖，將原料中的發酵底物轉化成乳酸等酸性物質，創造酸性環境，抑制有害微生物增殖，從而保存原料營養成分的過程。優質青貯飼料不僅保持了青綠飼料的鮮綠和大部分營養，而且增加了粗蛋白的含量；同時又具有芳香的酸味，柔軟多汁，適口性好等特點。在青貯飼料中含有多種乳酸菌，包括乳桿菌（lactobacillus）、腸球菌（Enterococcus）、明串珠菌（Leuconstoc）、乳球菌（Lactococcus）和片球菌（Pediococcus）等，為提高青貯品質，分離飼料中優質乳酸菌顯得尤為重要。歐盟國家和美國的研究者對乳酸菌在青貯飼料中的應用進行了大量深入的研究，研究內容包括優良乳酸菌的篩選、其對青貯飼料發酵品質和二次發酵抑制作用的影響、以及青貯飼料添加乳酸菌在奶牛飼養中的應用等。例如，有學者指出附著在新鮮牧草上的微生物，特別是乳酸菌，對青貯料的發酵過程和品質起重要作用。乳酸菌和其它種類的微生物在青貯發酵過程中共同生長，且影響到青貯料的發酵特性。在發酵過程中，牧草中的乳酸菌將糖轉變為乳酸，最終pH值降低，而牧草得以保存。

目前市面上的乳酸菌添加劑多是針對玉米的菌劑，用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑還未見報道。南方地區常年陰雨天氣較多，干草調制受天氣條件影響不易成功，而青貯不受天氣條件影響，是保存牧草的有效方法，作為我國南方地區廣泛種植的牧草多花黑麥草來說，開發針對其青貯料的乳酸菌添加劑有重要的應用價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠提高青貯料的發酵品質和營養價值的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案為：該用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑，所述添加劑由第一菌種和第二菌種混合而成，其中第一菌種為植物乳桿菌LP，第二菌種為乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種，所述第一菌種與第二菌種的容積比例為1：（1～3）。

進一步的是，所述第二菌種為魏斯氏菌WB。

進一步的是，所述植物乳桿菌LP與魏斯氏菌WB的容積比例為1：3。

本發明還提供了一種制備上述用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑的制作方法，該制作方法包括以下步驟：

A、制備乳酸菌培養基，將培養基各組分加入容器中，然后進行加熱攪拌，待所有組分都充分溶解后，裝入培養皿中并將其密封，然后將其放置于高壓滅菌爐中進行滅菌處理，滅菌處理結束后，取出培養皿，將其放置于無菌操作臺上，開啟紫外燈對其照射一段時間，照射結束后吹風使培養基凝固；

B、制備多花黑麥草的綠汁發酵液，將多花黑麥草原料剪切成2～3cm長的碎段，將切碎后的原料加入高速組織勻漿機中，再加入無菌蒸餾水進行攪碎，將攪碎的汁液用紗布過濾，用量筒稱量濾液容積，加入相應重量的葡萄糖以使濾液中葡萄糖濃度達到20g/L，充分混勻后倒入容量瓶中，濾液要裝滿容量瓶且不留空氣，將容量瓶蓋子蓋好并用膠布纏繞密封；

C、從綠汁發酵液中分離、純化乳酸菌，將步驟B制得的綠汁發酵液置于30℃恒溫培養箱中厭氧發酵48h，從綠汁發酵液放置在30℃恒溫培養箱中厭氧發酵開始，每隔4h在無菌操作臺上打開一瓶綠汁發酵液，用接種針蘸少許中層發酵液后在培養基上進行劃線，每瓶綠汁發酵液用三個培養基進行劃線，直至第48h全部綠汁發酵液均進行過劃線操作為止，將劃過線的培養基放置在30℃的恒溫培養箱中培養，每隔兩天在無菌操作臺上用接種針挑取培養基上的單個菌落得到純的乳酸菌菌株；

D、對挑取的單個菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，觀察各個菌株在顯微鏡下的形態特征從而確定菌株的陰性和陽性；

E、對純的乳酸菌菌株進行生化鑒定，在無菌操作臺上用接種針挑取單菌落置于含不同糖類的生化鑒定管中，將生化鑒定管用蠟密封后置于35℃恒溫培養箱中培養24h，之后根據生化鑒定管中的顯色反應并結合步驟D得出的結論對得到的菌株進行初步分類；

F、對乳酸菌菌株進行分子鑒定，具體步驟如下：首先，提取乳酸菌菌株的基因組DNA，其次，對提取的基因組DNA進行PCR反應，得到瓊脂糖凝膠，接著，從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，得到PCR產物，最后，對得到的PCR產物進行測序，根據步驟E得出的結論，將測得的序列與Genbank中的已知序列進行比對，尋找同源性最高的菌種，從而確定菌株的類別；