[發(fā)明專利]組合型胺類代謝標志物的應用及試劑盒與檢測方法

有效

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• 申請日: 2014-05-20
• 公開（公告）號: CN105092753A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發(fā)明（設計）人: 許國旺;羅萍;尹沛源;黃強
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.組合型胺類代謝標志物的應用，即組合型胺類代謝標志物在制備用于診斷受試者中的早期肝性腦病患者的試劑盒的用途，所述組合標志物由天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸共同構成。

2.一種檢測受試者中的早期肝性腦病的試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)標準品：天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸，所述標準品分別用于對應的血清中胺類代謝物天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的定性；

(2)含內標的提取液：所述提取液用于預處理來自受試者的血清樣品，為包含至少一種內標物的乙腈溶液，含內標的提取液為：1-5ug/ml穩(wěn)定同位素標記的色氨酸、1-5ug/ml穩(wěn)定同位素標記的丙氨酸、1-5ug/ml穩(wěn)定同位素標記的亮氨酸和1-5ug/ml穩(wěn)定同位素標記的胸腺嘧啶中一種或二種以上的乙腈溶液；

(3)衍生化試劑：5mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液、0.5mol/L丁胺水溶液和0.15mol/L的碳酸鈉和0.15mol/L的碳酸氫鈉的混合水溶液；

(4)洗脫液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液和0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。

3.根據(jù)權利要求2所述試劑盒，其中受試者包括早期肝性腦病患者，及對照的肝硬化患者和/或正常人。

4.一種計算受試者的血清樣品中的組合標志物變量的方法，所述組合標志物由天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸共同構成，所述方法包括以下步驟：

1)以含有內標物的提取液處理來自受試者的血清樣本，沉淀血清蛋白后，提取上清、凍干；隨后對凍干的粉末進行2步丹磺酰氯衍生法衍生，步驟如下：加5mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液50uL和0.15mol/L的碳酸鈉和0.15mol/L的碳酸氫鈉的混合水溶液50uL，渦旋30-60s，封上封口膜，放置60攝氏度水浴震蕩50mins，去上封口膜，再加入0.5mol/L丁胺水溶液30uL，60攝氏度水浴震蕩40mins除去未反應完的丹磺酰氯，水浴后離心，取上清，采用質譜正離子模式檢測分析；

2)在液相色譜-質譜分析獲得的總離子流圖上，提取天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸衍生后所對應離子的色譜峰；天冬氨酸衍生后離子的提取參數(shù)為:質核比為367.0962±0.005的離子，鳥氨酸衍生后離子的提取參數(shù)為:599.1995±0.005的離子，次黃嘌呤衍生后離子的提取參數(shù)為:370.0972±0.005的離子，苯丙氨酰苯丙氨酸衍生后離子的提取參數(shù)為:546.2061±0.005的離子，谷氨酰苯丙氨酸衍生后離子的提取參數(shù)為:759.2449±0.005的離子；

3)以試劑盒中五種胺類物質天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的標準品對檢測到的離子進行定性；將濃度為4-50ug/ml的五種胺類物質標準品水溶液在步驟1)相同條件下衍生后，進行液相色譜-質譜分析，確定五種標準品衍生后對應離子的保留時間以及實測質核比，與在受試者樣本中實測的五種物質相比較；

4)對每一受試者樣本中經(jīng)定性后的五種物質的色譜面積分別與提取液中的內標物比較，獲得天冬氨酸、鳥氨酸、次黃嘌呤、苯丙氨酰苯丙氨酸和谷氨酰苯丙氨酸的相對濃度；

5)以上述五種胺類代謝物的相對濃度值，基于二元邏輯回歸方程計算組合標志物變量P。

5.根據(jù)權利要求4所述計算受試者的血清樣品中的組合標志物變量的方法，其中受試者包括早期肝性腦病患者，及對照的肝硬化患者和/或正常人。