[發明專利]一種米根霉與皺褶假絲酵母偶聯生產L-蘋果酸的方法

在審

• 申請號: 201410204551.X
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN103966301A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 李鑫;顧夕梅;勇強;余世袁;歐陽嘉;徐勇;朱均均;周瑾;奚曉桐;沈怡
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P7/46;C12R1/845;C12R1/72
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明涉及微生物發酵產有機酸領域，具體涉及一種利用米根霉與皺褶假絲酵母偶聯制備L-蘋果酸的方法。

背景技術

L-蘋果酸是生物體三羧酸的循環中間體，口感接近天然果汁并具有天然香味，與檸檬酸相比，產生的熱量更低，口味更好，因此廣泛應用于酒類、飲料、果醬、口香糖等多種食品中，并有逐漸替代檸檬酸的勢頭。L-蘋果酸是目前世界食品工業中用量最大和發展前景較好的有機酸之一。

L-蘋果酸中含有天然的潤膚成分，能夠很容易地溶解粘結在干燥鱗片狀的死細胞之間的“膠粘物”，從而可以清除皮膚表面皺紋，使皮膚變得嫩白、光潔而有彈性，因此在化妝品配方中備受青睞；L－蘋果酸可以配制多種香精、香料，用于多種日用化工產品，如牙膏、洗發香波等；與檸檬酸相比，L－蘋果酸其酸味柔和別致，因此國外將其用于替代檸檬酸作為新型洗滌助劑，用于合成高檔特種洗滌劑。

L-蘋果酸可用于藥物制劑、片劑、糖漿中，還可以配入氨基酸溶液中，能明顯提高氨基酸的吸收率；L-蘋果酸可以用于治療肝病、貧血、免疫力低下、尿毒癥、高血壓、肝衰竭等多種疾病，并能減輕抗癌藥物對正常細胞的毒害作用；還可用于制備和合成驅蟲劑、抗牙垢劑等。另外L-蘋果酸還可以作為工業清洗劑、樹脂固化劑、合成材料增塑劑、飼料添加劑等。

目前，L-蘋果酸的生產方法主要為微生物發酵法和酶法。微生物發酵法產L-蘋果酸，又分為“一步發酵法”和“兩步發酵法”。“一步發酵法”(即直接發酵法)，利用微生物(如黃曲霉、米曲霉、稗疣黑粉菌、溫特曲霉等菌株)一步將葡萄糖、淀粉基碳源或富馬酸等原料轉化為L-蘋果酸。“兩步發酵法”采用兩種不同功能的微生物，一種微生物先將葡萄糖或其他碳源轉化為富馬酸(延胡索酸)，再由另外一種微生物將富馬酸轉化為L-蘋果酸。“兩步發酵法”常采用的微生物主要有少根霉、華根霉、膜醭畢赤酵母、普通變形桿菌、短乳桿菌、產氨桿菌等。酶法生產L-蘋果酸，以產氨短桿菌、黃色短桿菌、文氏曲霉等微生物作為產酶菌種， 經繁殖培育后獲得延胡索酸酶，再以富馬酸或富馬酸鹽為原料，經延胡索酸酶轉化，直接生成L-蘋果酸。微生物發酵法，由于菌種產蘋果酸比較低，適應規模化生產的菌種較少，因此，未有工業化大規模生產報道；酶法制備L-蘋果酸，雖有工業化報道，但由于其原料成本偏高，制約了大規模生產。

米根霉(Rhizopus oryzae)是美國FDA認證的公認安全(GRAS)的菌種，具備多種生物基化學品的生物制造能力，如乳酸、富馬酸、蘋果酸、乙醇等，發酵產物中不存在對人體和動物有害的物質。米根霉具有獨特的優點：營養要求簡單，培養基成本低廉；生長粗獷，不易染菌，且具備較強產酸能力和耐酸能力；下游分離純化負擔較輕；菌體易形成絲狀或小球，可與發酵液分離，簡化工藝過程。目前，米根霉廣泛應用于L-乳酸和富馬酸的發酵，但較少應用于L-蘋果酸的發酵，且米根霉發酵為異型發酵，有多個發酵終產物，如富馬酸、L-蘋果酸等。

皺褶假絲酵母(Candida rugosa)，原名柱狀假絲酵母，是一種半子囊不產孢子的假絲狀單細胞非致病酵母真菌。該酵母通常被認為是對人類和其它生命形式都是安全的，主要應用于正烷烴轉化富馬酸、脂肪酶的生產。

但是未見米根霉與皺褶假絲酵母聯合發酵生產L-蘋果酸的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種米根霉與皺褶假絲酵母偶聯生產L-蘋果酸的方法。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種米根霉與皺褶假絲酵母偶聯生產L-蘋果酸的方法，它包括如下步驟：

(1)皺褶假絲酵母經種子培養后，再經擴大培養，過濾回收菌體備用；其中，所述的擴大培養，先在33℃下發酵培養48h，再在35℃下繼續發酵培養48h；

(2)米根霉經種子培養形成孢子懸濁液，再經發酵基礎培養直至形成顆粒狀菌體；

(3)將經過步驟(2)發酵基礎培養后的米根霉接種于發酵培養基中，以碳酸鈉控制pH值4.0～5.0，35℃下發酵生產富馬酸和L-蘋果酸，發酵48～60h后，用氨水調節pH值至7.5～8.0，再接入步驟(1)得到的皺褶假絲酵母，維持35℃，與米根霉共培養至全部富馬酸轉化為L-蘋果酸。

步驟(1)中，所述的皺褶假絲酵母經種子培養和擴大培養后，菌體密度為30g濕菌體/L以上。