[發明專利]一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法

有效

• 申請號: 201410200628.6
• 申請日: 2014-05-14
• 公開（公告）號: CN104152518B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 丁國芳;滕芳芳;楊最素;劉晨晨
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及海洋生物提取技術領域，特別涉及一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法。

背景技術

鱈魚皮由于其蛋白含量高，故其主要的生物活性成分即為活性肽。現在研究發現，鱈魚皮生物活性肽具有抗氧化、抗病毒、抗胃潰瘍等作用。Dai-Hung?Ngo等從太平洋鱈魚皮中分離純化兩種膠原蛋白肽，Thr-Cys-Ser-Pro?(388?Da)和?Thr-Gly-Gly-Gly-Asn-Val?(485.5?Da)。通過電子自旋共振法證明了純化的肽的抗氧化活性，?同時也具有血管緊張素轉換酶抑制作用，說明鱈魚皮膠原蛋白肽具有抗氧化和抗高血壓的作用（Dai-Hung?Ngoa,?BoMi?Ryua,?Thanh-Sang?Voa,?et?al.?Free?radical?scavenging?and?angiotensin-I?converting?enzyme?inhibitory?peptidesfrom?Pacific?cod?(Gadus?macrocephalus)?skin?gelatin?[J].?International?Journal?of?Biological?Macromolecules,?2011,?4(9):1110–1116）。宛寧從鱈魚皮中分離的到一種膠原蛋白肽PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL，該肽能直接作用于病毒顆粒，病毒的凝集價顯著降低且成劑量依賴性，具有極強的流感病毒神經氨酸酶抑制活性，活性肽的抗病毒作用具有多靶點（苑寧.?鱈魚皮中流感病毒神經氨酸酶抑制活性肽的研究[D].青島:中國海洋大學,2013）。王志聰等探究鱈魚皮膠原蛋白肽的抗酒精性胃潰瘍作用，采用酒精誘導大鼠急性胃潰瘍模型，試驗組灌胃給予不同劑量的膠原肽，檢測胃潰瘍指數、胃潰瘍抑制率并對胃潰瘍病灶部位進行組織學觀察。結果與模型組相比，各受試物均能夠降低大鼠胃腺的出血損傷，降低胃潰瘍指數，具有良好的抗酒精性胃潰瘍作用（王志聰,孫京沙,倪鑫,等.?鱈魚皮膠原蛋白肽的抗酒精性胃潰瘍作用[J].?中國海洋藥物雜志,?2012,?35(5):17-22?）。

目前，膠原蛋白肽的保健功能主要在美容護膚、補鈣健骨、止血免疫等方面，但是現在還未有研究關于膠原蛋白肽對肝臟的損傷保護作用，而現有的肝臟損傷的保護主要依靠各類藥物，但是藥物都存在一定的毒性和抗藥性，生物活性肽是具有無毒、安全的特點，是理想的輔助治療材料，亟需開發一種對肝臟的損傷保護效果好的生物活性肽。

發明內容

本發明的目的在于提供一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，以水產加工副產物鱈魚皮為原料，從中提取具有肝細胞修復作用的膠原蛋白肽，簡單易行，生產成本低，可以顯著提高水產加工副產品的價值，避免浪費的同時還保護了環境，還能為開發相關功能性食品提供前期基礎。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：?

一種肝病輔食型鱈魚皮膠原蛋白肽的制備方法，包括以下步驟：

（1）鱈魚皮預處理：將鱈魚皮洗凈后用4℃純水浸泡20-30min，后用濃度0.1-0.2mol/L?NaOH?浸泡?6-8小時，用清水沖洗至?pH=7，瀝干水分后，用濃度0.1-0.2mol/L的冰醋酸溶脹10-12小時，最后用剪刀剪碎；

（2）酶解反應：將步驟（1）預處理后的鱈魚皮與水按照1:4（w/v）的料液比混合，然后加入胰蛋白酶酶解反應；

采用胰蛋白酶酶解的產物對肝細胞的損傷修復效果最好。

（3）超濾：步驟（2）酶解反應結束后，滅酶，離心，收集上清液，上清液用超濾膜超濾，截留獲得分子量為5-10KDa的組分，冷凍干燥后得GM2組分；GM2組分對肝細胞的損傷修復效果最好。

（4）DEAE-Sepharose?FF離子交換層析分離：將GM2組分上DEAE-Sepharose?FF離子交換柱，采用pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液作為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后得到GM2-2組分；GM2-2組分對肝細胞的損傷修復效果最好。

（5）Sephadex?G-25層析分離：將GM2-2組分經Sephadex?G-25凝膠柱洗脫后，從上樣開始計時，收集90-100min時間段洗脫液獲得GM2-2-3組分，冷凍干燥后得到肝病輔食型膠原蛋白肽。GM2-2-3組分對肝細胞的損傷修復效果最好。

作為優選，步驟（2）酶解條件為：胰蛋白酶用量為每g鱈魚皮加入2000U，酶解溫度50℃，pH?6，時間8h。這樣的條件下酶解效果最好，所得產物對肝細胞的損傷修復效果最好。