[發(fā)明專利]基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410198205.5
• 申請日: 2014-05-12
• 公開（公告）號: CN104004716A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳智;劉艷寧;樓國華;王靜;吳珊珊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

1.一種基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，其特征在于：所述篩選模型采用帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞株，通過中藥單體對該類細(xì)胞的PNC抑制率進(jìn)行篩選。

2.如權(quán)利要求1所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，其特征在于：帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞株腫瘤細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移特性，并具有GFP標(biāo)記的PNC。

3.如權(quán)利要求1所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，其特征在于：帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞株的腫瘤為實體瘤。

4.如權(quán)利要求3所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型，其特征在于：帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞株的腫瘤細(xì)胞株為帶GFP標(biāo)記PNC的MDA-MB-231M(乳腺癌細(xì)胞株)，SPC-A-1M(人肺腺癌細(xì)胞株)或HepG2M(肝癌細(xì)胞株)。

5.權(quán)利要求1所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)通過腫瘤細(xì)胞株原位接種-分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶-體外培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞株-再次原位接種，重復(fù)以上循環(huán)5次，獲得高轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞株；

2)構(gòu)建帶GFP標(biāo)記的PTB表達(dá)質(zhì)粒(GFP-PTB)：通過高保真DNA聚合酶以PCR法擴(kuò)增人PTB?cDNA序列，擴(kuò)增后的片斷在HindIII和BamH1位點處插入GFP表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1，獲得帶GFP標(biāo)記的PTB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒；

3)上述GFP-PTB融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟1中的高轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞株，并通過G418篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；

4)熒光顯微鏡觀察上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中的PNC比例，均達(dá)到95％以上，即得到可用于抗轉(zhuǎn)移中藥單體篩選的帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞模型。

6.如權(quán)利要求5所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟1)所述腫瘤細(xì)胞株為乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231M，人肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1M、肝癌細(xì)胞株HepG2M。

7.權(quán)利要求1所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的應(yīng)用，其特征在于：基于中藥單體對帶GFP標(biāo)記PNC的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞株的PNC抑制率的分析來篩選藥物。

8.權(quán)利要求1所述的基于PNC的抗轉(zhuǎn)移中藥單體的篩選模型的應(yīng)用，其特征在于：包括如下步驟：

1)采用CCK8法分析備選中藥單體對權(quán)利要求2所述細(xì)胞的生長抑制情況，計算48h時間點的GI50％和GI99％藥物濃度；

2)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞爬片過夜后，分別加入GI50％和GI99％濃度的中藥單體作用24小時后，用4％多聚甲醛固定，并水洗封片后于鏡下觀察；

3)采用熒光顯微鏡檢測中藥單體作用后的PNC比例，每次計數(shù)100個細(xì)胞，計數(shù)3次后取平均值；或采用激光共聚焦顯微鏡成像后，配合Stereo?Investigator軟件計數(shù)中藥單體作用后的腫瘤細(xì)胞PNC比例；

4)計算PNC抑制率：PNC抑制率＝(助溶劑DMSO組的PNC比例-中藥單體組的PNC比例)/助溶劑DMSO組的PNC比例×100％，再行統(tǒng)計分析；

5)以中藥單體的PNC抑制率作為篩選依據(jù)：在GI50％濃度時達(dá)到30％以上PNC抑制率的作為優(yōu)先選擇，以GI99％濃度達(dá)到30％以上PNC抑制率的作為第二選擇。