[發(fā)明專利]不依賴信號序列的pIX噬菌體展示

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410196799.6
• 申請日: 2010-02-24
• 公開（公告）號: CN104017778A
• 公開（公告）日: 2014-09-03
• 發(fā)明（設計）人: 蓋爾·奧耶·洛塞特
• 申請（專利權）人: 內克斯特伊拉股份公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C40B40/02;C12R1/92
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 王思琪;鄭霞

本申請是申請日為2010年2月24日，申請?zhí)枮?01080013437.9，發(fā)明名稱為“不依賴信號序列的pIX噬菌體展示”的申請的分案申請。

發(fā)明背景

用于蛋白鑒定、表征和修飾的組合方法的使用已經在學術和商業(yè)研發(fā)中取得了巨大成功。在這方面，絲狀噬菌體或噬菌體展示技術已經鋪平了第一個文庫平臺的道路，并依然占據主導技術的寶座。因此，噬菌體展示廣泛應用于基礎蛋白和應用蛋白的發(fā)現(xiàn)以及基于新蛋白的診斷劑和治療劑的開發(fā)中，基于新蛋白的診斷劑和治療劑是世界范圍內增加最迅速的化合物類別。

組合噬菌體展示技術的原理是基于每個病毒粒子將在其表面僅展示由其蛋白外殼包裹的基因組編碼的完全相同蛋白的性質所提供的基因型-表型關聯(lián)。噬菌體粒子本身對許多理化條件高度耐受；因此，噬菌體展示與競爭組合技術相比提供在許多篩選方案中的優(yōu)越通用性。

已經使用絲狀噬菌體外殼的全部五種結構蛋白實現(xiàn)了異源多肽的噬菌體展示，但只有pIII展示和一定程度上pVIII展示獲得了廣泛使用(圖1)。

當異源融合體僅是短肽時，使用基于噬菌體基因組的載體的多價展示系統(tǒng)是優(yōu)選的，而對于需要折疊結構域的較大融合體而言，大多數應用將受益于噬菌粒系統(tǒng)。在后一情況下，截至目前，抗體-pIII噬菌體展示主導該領域，但替代支架即將出現(xiàn)，依然需要發(fā)展未來的蛋白工程工具。非常希望的應用是簡單地通過噬菌體病毒粒子感染細菌從噬菌體展示文庫有效獲得高親和力特異性肽或蛋白結合物而同時依然結合其靶。

Endemann和Model,1995(PMID:7616570)報道了次要外殼pIX對融合至其N末端的另一蛋白無功能性。因此，該報道得出pIX不能用于噬菌體展示的結論。

Gao等人(PMID:10339535、12239343和WO0071694)和Khalil等人(PMID:17360403)二者后來顯示，當從噬菌粒表達并與信號序列依賴性周質靶向組合使用時，允許N末端pIX融合體展示。在這些系統(tǒng)中，由于在噬菌粒拯救時從輔助噬菌體基因組提供wt?pIX而發(fā)生補充。

WO0071694圖2A(未插入融合蛋白)和WO0071694圖2B(插入融合蛋白)中公開的噬菌粒清楚地包含pelB信號序列(圖文字在第7頁，第2-14行)。

如上所述，之前已經表明，pIX對融合至N末端的另一蛋白無功能性，并且Gao等人提出其成功的單獨的兩個可能原因或兩者組合。

一個可能的原因是原核前導序列(信號序列)N末端連接至融合蛋白，由此保證重組蛋白靶向周質空間，并從而防止在胞質中的累積。

另一個可能的原因是，如根據Endemann和Model，重組蛋白從噬菌粒而非噬菌體基因組表達，因此，來自噬菌粒拯救所必需的輔助噬菌體的野生型pIX補充重組pIX融合蛋白，由此保留了野生型功能性，否則野生型功能性可能由于重組修飾而喪失。即，噬菌體將包含野生型蛋白和融合蛋白的混合物。

Khalil等人(PMID:17360403)描述了利用雙特異性絲狀噬菌體病毒粒子特征的應用，其中外源性肽展示在完全相同的病毒粒子的每個遠端。他們通過使用普通pIII噬菌體基因組載體補充原核信號序列依賴性pIX展示噬菌粒的組合來實現(xiàn)該目的。在這種情況下，噬菌體基因組載體用作拯救噬菌粒的輔助噬菌體。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個目的是提供用于在絲狀噬菌體上展示的肽的替代支架。

本發(fā)明第一個方面是源自絲狀噬菌體的pIX融合蛋白，所述融合蛋白不包含原核N末端信號序列并因此直接融合至外源性肽。

本發(fā)明另一方面涉及編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸。

本發(fā)明一個方面涉及包含本發(fā)明融合蛋白的絲狀噬菌體。

本發(fā)明另一方面涉及絲狀噬菌體文庫。

本發(fā)明另一方面涉及包含噬菌粒和輔助噬菌體的噬菌體展示系統(tǒng)，其中所述噬菌粒包含編碼本發(fā)明pIX融合蛋白的核酸。

一個方面涉及包含噬菌體展示系統(tǒng)的試劑盒，所述噬菌體展示系統(tǒng)包含噬菌粒和輔助噬菌體，其中所述噬菌粒包含編碼本發(fā)明pIX融合蛋白的核酸。

附圖簡述

圖1