[發明專利]一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法

有效

• 申請號: 201410189097.5
• 申請日: 2014-05-07
• 公開（公告）號: CN103926283A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 楊紹明;陳愛喜;李紅;李瑞琴;尚培玲
• 申請（專利權）人: 華東交通大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N33/573
• 代理公司: 南昌市平凡知識產權代理事務所 36122
• 代理人: 姚伯川

技術領域????

本發明涉及一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，尤其涉及一種以水滑石-碳納米管復合納米材料制備用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的方法，屬納米材料和電分析化學檢測技術領域。

背景技術????

凝血酶是人體內不可或缺的一種生理蛋白酶，具有快速止血的作用，能使血漿內的纖維蛋白原從可溶性轉變成不溶性。在傷口愈合、凝血等病理和生理過程中扮演著關鍵的角色，因此對凝血酶的測定在臨床應用和病理分析上具有十分重要的現實意義。近年來，檢測凝血酶的電化學核酸適配體傳感器，由于其具有簡單、快速、靈敏、成本低廉和易于實現微型化等優點，受到眾多研究者的青睞。

核酸適配體是在體外通過指數級富集配體系統進化技術篩選出的一段由20~60個堿基所組成的單鏈或雙鏈寡聚核苷酸，具有高親和力，易于修飾和功能化，能與配體高效、專一結合等特點。基于核酸適配體的電化學核酸適配體傳感器，根據是否采用標記物產生檢測信號，可分為標記型和非標記型；根據測量信號，電化學核酸適配體傳感器可分為電流型、電壓型和阻抗型。阻抗型電化學核酸適配體傳感器因靈敏度高、制備工藝簡單和非標記等優點而日益受到關注。阻抗型核酸適配體傳感器是通過檢測核酸適配體與靶分子雜交前后的電極界面變化而實現對靶分子的檢測。

水滑石是由二價和三價金屬離子組成的金屬氫氧化物層與層間填充的陰離子而構成的一類無機層狀化合物。利用水滑石離子交換性能好、表面積大、生物相容性良好等特點，可以作為有效固定化核酸適配體的載體，進而將核酸適配體固定在電極表面。

碳納米管是一種具有比表面積大、生物相容性好、電子傳遞速度快等優點的納米材料，具有獨特的結構和電化學性質，可用于增強電化學傳感器的性能。

以碳納米管和水滑石兩者有機結合起來的復合納米材料為載體構建的生物傳感器，因碳納米管和水滑石的協同作用，可顯著地提高傳感器的性能。目前，制備水滑石-碳納米管復合納米材料的方法有化學合成法和多步電沉積法，這兩者方法步驟繁瑣、時間長。

發明內容????

本發明的目的是，針對目前檢測凝血酶的核酸適配體傳感器的靈敏度較低，制備傳感器的方法操作復雜的缺點，提供一種以水滑石-碳納米管復合納米材料制備核酸適配體傳感器并用于檢測凝血酶的方法。

實現本發明的技術方案是，本發明采用一步電沉積法制備水滑石-碳納米管復合納米材料，以其為固定化核酸適配體的載體構建測定凝血酶的阻抗型電化學傳感器。通過簡單的一步電沉積法，將水滑石和碳納米管共同修飾在電極表面，利用水滑石和碳納米管的大比表面積、良好的生物相容性和強吸附作用的協同效應，將大量的核酸適配體穩定地負載在電極表面，然后以牛血清蛋白封閉電極表面的空白位點，即可構建核酸適配體生物傳感器，最后采用電化學阻抗用于凝血酶的分析檢測。

本發明提出一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，所述方法步驟如下：

（1）將硝酸鈷和硝酸鋁溶液混合成溶液A，將硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管混合成懸浮液B，按A和B的體積比0.5～2.0，將溶液A和懸浮液B混合成懸浮液C。

所述溶液A的配制方法為：溶液A中硝酸鈷和硝酸鋁的摩爾比為1:1～5:1，溶液A中硝酸鈷和硝酸鋁的總濃度為0.01～0.05?mol/L。

所述懸浮液B的配制方法為：溶液B中硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管的濃度分別為0.1～0.4?mol/L、0.05～0.2?mol/L、0.5～2.0?mg/mL。

（2）將干凈的玻碳電極在混合懸浮液C中-0.7～-1.2?V電位下電沉積30～300?s，得到水滑石-碳納米管復合納米粒子修飾的玻碳電極。

（3）將（2）得到的水滑石-碳納米管修飾電極依次置于0.5～2.0μmol/L的凝血酶適配體中12～24?h，0.5～2.0?mg/mL的牛血清白蛋白中浸泡20～60?min，制得水滑石-碳納米管/核酸適配體/牛血清白蛋白修飾電極，該核酸適配體修飾電極即為測定凝血酶的核酸適配體傳感器。

本發明基于水滑石-碳納米管復合納米材料制備的核酸適配體傳感器檢測凝血酶的方法如下：

本發明利用傳感器中水滑石-碳納米管復合納米材料負載的核酸適配體對凝血酶的特異性結合，導致電極界面的阻抗變化可用于對凝血酶的檢測，將前述的核酸適配體修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑電極，組成三電極體系，即可實現對凝血酶的檢測。