[發明專利]糖蜜中生物素的提取方法及其薄層層析掃描檢測方法

有效

• 申請號: 201410188077.6
• 申請日: 2014-05-06
• 公開（公告）號: CN103926369A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 劉代成
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: G01N30/90
• 分類號: G01N30/90;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 彭成

1.一種糖蜜中生物素的提取方法，其特征在于：步驟如下：

(1)取糖蜜10g，加15～25ml?N,N-二甲基甲酰胺，攪拌均勻，過濾，用20～40ml無水乙醇沖洗濾渣，過濾，將濾渣加入到70～100ml無水乙醇中，在70～78℃、40Hz、400～500W條件下超聲處理28～32min，然后趁熱過濾，得濾液，濾液經旋轉蒸發得樣品粗液；

(2)取2ml鹽酸苯肼溶液，加入到上述樣品粗液中，混勻，在90～98℃下水浴加熱28～32min，然后放在-10～-26℃下冷凍30～40分鐘，取出，除去下層沉淀，得上清液；

所述鹽酸苯肼溶液是通過以下方法制備得到的：稱取鹽酸苯肼0.3g，加3ml蒸餾水，加熱溶解；稱取0.45g乙酸鈉，加入3ml蒸餾水溶解；將兩種液體合并，即得；

(3)取0.01～0.02g吸附劑，加入到步驟(2)所得上清液中，攪拌吸附0.5～1h，然后6000～8000轉/分離心，得上清液，即為生物素溶液；

所述吸附劑是通過以下方法制備得到的：取硅藻土1g、活性白土1g和糖用活性炭1g，混合混勻，即得。

2.一種生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于：步驟如下：

(1)取待檢測樣品液4μl，點在硅膠板上，向展開缸加入展開劑，在展開缸內展開，展程15cm，然后將薄層板拿出放在通風柜中晾干；同時，采用外標一點法點4μl不同濃度的生物素標準品溶液，同時展開；

所述展開劑為氯仿-甲醇-甲苯-乙酸混合液，其中，氯仿、甲醇、甲苯、乙酸四者的體積比為4～4.5：0.5～0.6：2～2.2：0.1～0.15；

(2)將2,4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和無水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛終濃度為0.1～0.2％，硫酸終濃度為1～2％；展完后晾干的展板，用染色液噴霧染色，得到與背景對比明顯的標準品的斑點和樣品的斑點；

(3)利用薄層掃描儀以530nm吸收波長進行薄層層析掃描，照射燈為鎢燈，檢測計算得到生物素標準品溶液質量和峰面積積分值的關系的回歸方程，然后根據樣品液的峰面積積分值計算出樣品液中生物素的質量濃度。

3.根據權利要求2所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于：所述硅膠板為涂有硅膠GF₂₅₄高效薄層板。

4.根據權利要求2所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于：所述生物素標準品溶液包括濃度分別為0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列標準品溶液。

5.根據權利要求2所述的生物素的薄層層析掃描檢測方法，其特征在于：所述樣品液是通過以下方法制備得到的：

(1)取糖蜜10g，加15～25ml?N,N-二甲基甲酰胺，攪拌均勻，過濾，用20～40ml無水乙醇沖洗濾渣，過濾，將濾渣加入到70～100ml無水乙醇中，在70～78℃、40Hz、400～500W條件下超聲處理28～32min，然后趁熱過濾，得濾液，濾液經旋轉蒸發得樣品粗液；

(2)取2ml鹽酸苯肼溶液，加入到上述樣品粗液中，混勻，在90～98℃下水浴加熱28～32min，然后放在-10～-26℃下冷凍30～40分鐘，取出，除去下層沉淀，得上清液；

所述鹽酸苯肼溶液是通過以下方法制備得到的：稱取鹽酸苯肼0.3g，加3ml蒸餾水，加熱溶解；稱取0.45g乙酸鈉，加入3ml蒸餾水溶解；將兩種液體合并，即得；

(3)取0.01～0.02g吸附劑，加入到步驟(2)所得上清液中，攪拌吸附0.5～1h，然后6000～8000轉/分離心，得上清液，為生物素溶液，即為樣品液；

所述吸附劑是通過以下方法制備得到的：取硅藻土1g、活性白土1g和糖用活性炭1g，混合混勻，即得。