[發明專利]促卵泡生成素（FSH）定量測定試劑盒及其制備方法與檢測方法

在審

• 申請號: 201410187359.4
• 申請日: 2014-05-05
• 公開（公告）號: CN105092862A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 楊旻;汪丹;夏振偉
• 申請（專利權）人: 江蘇澤成生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

1.一種促卵泡生成素(FSH)定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑和發光底物；所述試劑盒中各組分按照如下方法制備：

一、校準品、質控品的配制：

采用校準品緩沖液溶解促卵泡生成素(FSH)，配置校準品和質控品；其中，所述校準品緩沖液是通過在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四環素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后經過0.22μm濾膜處理制備；

二、抗試劑的配制：

(1)、抗試劑緩沖液的制備：

Tris：12.12mg～60.57mg，四環素：0.01g～0.05g，綿羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，馬血清1g～5g加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解；

(2)、將異硫氰酸熒光素標記的促卵泡生成素(FSH)包被抗體和堿性磷酸酶標記的促卵泡生成素(FSH)標記抗體加入到所述抗試劑緩沖液中充分攪拌至完全溶解；

三、磁微粒試劑的制備：

將抗異硫氰酸熒光素抗體與羧基磁珠偶聯制得磁微粒試劑；

四、發光底物的制備：

將ALPS溶解于發光底物緩沖液中制得發光底物。

2.根據權利要求1所述的促卵泡生成素(FSH)定量測定試劑盒，其特征在于，所述抗試劑的制備方法如下：

(1)、異硫氰酸熒光素與促卵泡生成素(FSH)的偶聯，獲得異硫氰酸熒光素標記的促卵泡生成素(FSH)包被抗體：

首先用抗試劑緩沖液將異硫氰酸熒光素配制成濃度為1.0～5.0mg/mL的異硫氰酸熒光素溶液，按照促卵泡生成素(FSH)與異硫氰酸熒光素的質量之比為1:1.1的量，將二者轉移到棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌1～2小時；充分反應后使用pH＝8～9的碳酸氫鹽緩沖液，進行平衡，然后凝膠層析分離純化出異硫氰酸熒光素標記的促卵泡生成素(FSH)抗體包被抗體；

(2)、堿性磷酸酶與促卵泡生成素(FSH)的偶聯，獲得堿性磷酸酶標記的促卵泡生成素(FSH)標記抗體：

首先用抗試劑緩沖液將堿性磷酸酶配制成濃度為1.0～5.0mg/mL的堿性磷酸酶溶液；按照堿性磷酸酶與促卵泡生成素(FSH)抗體的摩爾比為1:2～1:10的量將二者轉移至棕色瓶中，室溫下攪拌4～5小時，充分反應后使用pH＝8～9的碳酸氫鹽緩沖液平衡，然后使用凝膠層析分離純化出堿性磷酸酶標記的FSH標記抗體；

(3)、將步驟(1)中獲得的異硫氰酸熒光素標記的促卵泡生成素(FSH)包被抗體和步驟(2)中獲得的堿性磷酸酶標記的促卵泡生成素(FSH)標記抗體，加入到含有表面活性劑的Tris鹽緩沖液中，充分攪拌后獲得所述抗試劑；所述表面活性劑為Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一種或多種，表面活性劑的添加量為0.01％～0.5％。

3.根據權利要求1所述的一種促卵泡生成素(FSH)定量測定試劑盒，其特征在于，所述磁微粒試劑是按照以下步驟制備的：

(1)、取一定體積的充分混勻后的羧基磁珠濃縮液至反應瓶中，將該反應瓶在磁場中放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反應瓶中加入2～5倍于反應瓶中羧基磁珠體積的磁微粒緩沖液，震蕩清洗20-30min；再將反應瓶置于磁場中15min后吸去上清；重復清洗羧基磁珠3遍；最后將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混勻；所述磁微粒緩沖液的配置方法是：Tris：12.12mg，氯化鈉5.82mg，甲基纖維醚50g，加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解；

(2)、連接反應：按照羧基磁珠與抗異硫氰酸熒光素抗體的質量比為100:1的比例，在羧基磁珠中加入抗異硫氰酸熒光素抗體，2～8℃下保持混勻狀態反應18小時；

(3)、反應瓶在在磁場放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒緩沖液洗3遍，隨后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需的磁微粒試劑。

4.根據權利要求1所述的一種促卵泡生成素(FSH)定量測定試劑盒，其特征在于，所述發光底物是按照以下步驟制備的：

用4～10倍于ALPS體積的發光底物緩沖液充分溶解ALPS；所述發光底物緩沖液的配置方法是：Tris12.12g～121.14g，氯化鈉5.82g，光澤精0.3g，加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，用鹽酸調節緩沖液的pH至9.5。