[發明專利]自然無血凝性水貂腸炎病毒株MEV-NH及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201410177502.1
• 申請日: 2014-04-29
• 公開（公告）號: CN103952378A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 譚斌;張淑琴;陳立志;吳威;李光玉;程世鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所;吉林特研生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所 22210
• 代理人: 王丹陽

技術領域

本發明涉及動物生物制品技術領域，具體涉及一種自然無血凝性水貂腸炎病毒株MEV-NH及其制備方法和應用。

背景技術

1949年，水貂腸炎病毒(Mink?enteritis?virus)在加拿大水貂飼養場流行，給養貂業造成了巨大損失。通過糞便濾液人工感染試驗，證實是一種病毒性傳染病，稱為貂腸炎病毒。有學者證實，貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)的抗血清能防止感染，FPV疫苗也可以預防貂病毒性腸炎。1967年，在感染貂臟器細胞培養物中分離到了MEV，伴隨著病毒增殖，出現短暫的核內包涵體和不同程度的細胞病變。MEV可在貓腎細胞系中生長，接種4～6天后，病毒達最高滴度。無論MEV的形態和理化學特性還是其抗原性、基因結構特點都與FPV十分近似，常規血清學方法不能將兩者區分開。

貂病毒性腸炎的暴發通常是季節性的，一般發生于7、8、9月份，糞口傳播是最主要的傳播途徑。由于MEV像其他細小病毒一樣對理化因素具有強大抵抗力，可通過飼養人員、流動人員、設備、工具和蒼蠅等傳播。一旦MEV傳入貂場，總是先感染就近貂，然后傳播到整個貂場。一般持續2～3周。貂病毒性腸炎潛伏期為4～8天，癥狀與貓泛白細胞減少癥近似。死亡率10～80％，幼貂死亡率更高。人工感染潛伏期為4～6天，癥狀是腹瀉、糞便稀軟，同時糞便中出現大量粘液，病貂拒食，脫水，糞便呈水樣，繼之死亡。病變主要限于腸道及淋巴結，小腸呈急性卡他性出血性腸炎，內容物水樣惡臭，腸系膜淋巴結腫脹。

病毒粒子外觀與FPV、CPV相同，直徑20～24nm，核酸由單股DNA組成，長約5000nt。絕大多數水貂腸炎病毒，在4℃下對豬紅細胞有凝集作用。

發明內容

為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種自然無血凝性水貂腸炎病毒株MEV-NH及其制備方法和應用。

本發明的自然無血凝性水貂腸炎病毒株MEV-NH，該水貂腸炎病毒(Mink?enteritis?virus)NH于2014年03月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.8858。其VP2基因序列如序列表SEQ?IE?NO?3所示；其VP2氨基酸序列如序列表SEQ?IE?NO?4所示。

本發明的自然無血凝性水貂腸炎病毒株MEV-NH的制備方法，該方法的條件和步驟如下：

采用山東省某貂場疑似水貂病毒腸炎發病貂的稀糞，將此病料用無血清MEM(青霉素、鏈霉素濃度各為2000U/mL)制成10％(v/v)懸液，凍融1次，以5000r/min離心10min，取上清，0.22μm濾膜除菌，-80℃保存用于病毒分離。將處理好的病料上清液按3％的比例同步接種于CRFK細胞，于37℃、5％CO₂培養箱中培養4～5天，觀察細胞病變(CPE)。病毒接種細胞CPE達80％左右，收取病毒培養物，反復凍融3次，用收獲培養物接種細胞進行病毒傳代得到水貂腸炎病毒(Mink?enteritis?virus)NH。

本發明的自然無血凝性水貂腸炎病毒株MEV-NH作為驗證疫苗免疫原性的檢驗強毒株的應用，采用1～2月齡健康水貂10只，隨機選取5只作為免疫組，每只各注射接種1頭份疫苗，剩余5只作為對照組，每只各注射生理鹽水2ml；21天后，所有10只水貂都接種水貂腸炎病毒MEV-NH流行株細胞培養物1ml，連續觀察14天，對照組水貂全部表現出水貂病毒性腸炎癥狀，而免疫疫苗組水貂全部未表現出水貂病毒性腸炎癥狀，說明該疫苗能夠對水貂產生無血凝性MEV-NH流行株的免疫保護作用。

本發明的有益效果是：

本發明中所發現并分離的水貂腸炎病毒株MEV-NH，在不同的溫度(4℃及20℃)，不同的PH值(PH值5.0至8.0)條件下都不會使多種動物(雞，豚鼠，豬，恒河猴及人O型血)的紅細胞發生凝集。水貂腸炎病毒株MEV-NH全基因組序列在GeneBank的登陸號為：JX535284。水貂腸炎病毒株MEV-NH為天然喪失血凝性，并非由細胞傳代過程中喪失。通過對原始糞拭子樣品檢測無血凝性，糞拭子上清接種傳代細胞可出現典型細小病毒病變，通過免疫熒光和全基因測序，證實為水貂腸炎病毒。

水貂腸炎病毒株MEV-NH為自然變異，天然喪失血凝性，對豬紅細胞不產生凝集作用。現有水貂病毒腸炎疫苗能否對變異的無血凝性水貂腸炎病毒流行株起到保護作用，可通過免疫動物后，使用水貂腸炎病毒MEV-NH株攻毒檢驗。

具體實施方式