[發明專利]長鏈二元酸生產菌株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410175544.1
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN105018362B
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 賴小勤;晏禮明;楊勇;陳遠童;傅深展;陶勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/87;C12P7/64;C12R1/72
• 代理公司: 北京怡豐知識產權代理有限公司11293
• 代理人: 于振強

技術領域

本發明涉及一種菌種及其制備方法和應用，具體說是一種長鏈二元酸生產菌株及其制備方法和應用。

背景技術

長鏈二元酸是重要化工原料，具有極其廣泛的用途，能夠合成香料、特種尼龍、高級潤滑油等一系列高附加值的化學品。長鏈二元酸可應用在軍用領域、航空航天器的涂層、管路、汽車的表面涂層及油管等；在民用領域，可應用于汽車、日化香料、工程塑料、尼龍行業等十多個高新科技行業，可開發出更多的下游產業，形成新興的產業鏈。

以往，長鏈二元酸采用化學合成法生產，其專利技術被國外所擁有。化學合成法生產長鏈二元酸，不僅產品種類單一，且合成工藝復雜、成本高、污染大。我國是世界上唯一能夠采用微生物發酵技術實現多種長鏈二元酸大規模工業化生產的國家。此前，我國二元酸生產菌種的改良均是通過不同方式誘變等傳統育方法實現的。傳統育種方法具有很大隨機性，篩選復雜。通過傳統育種的方法已經很難進一步提高菌株的性能。當前長鏈二元酸工業化生產過程中仍有許多瓶頸問題，如底物轉化率有待提高、生產能耗非常巨大等等。

代謝工程技術可以在基因水平上有針對性的進行菌種分子改造，獲得性能更加優良的新菌株。如圖1、圖2所示，二元酸代謝途徑主要包括ω-氧化途徑和β-氧化途徑，其中前者為二元酸合成途徑，后者涉及二元酸降解途徑。代謝工程的目的是通過分子改造手段來提高ω-氧化活性，并降低β-氧化活性。國際上，Henkel公司(后來的Cognis公司)有專利報道(US005254466A)，用基因敲除方式來優化二元酸生產菌株，依次將4個POX基因敲除，達到完全阻斷β-氧化，使底物轉化率提高為100％。在此基礎上，該公司進一步通過代謝工程手段共表達CYP單加氧酶和還原酶，以達到增強ω-氧化的目的，產量提高30％(World Patent WO/91/06660)。

但是利用該菌株進行批式發酵實驗，其工藝仍無法與當時其他二元酸生產工藝競爭，而最終沒有進行規模化生產。Henkel公司對菌種進行分子改造所使用的篩選標記為尿嘧啶營養缺陷型。Henkel公司發明專利的缺點為：1、出發菌株不是工業化生產所用的高產菌株；2、發酵法生產長鏈二元酸所用的假絲酵母為二倍體，即每個細胞具有兩套染色體，每個基因都有對應的等位基因，而且催化每步體內生化反應的酶往往由多個基因編碼。因此，通過代謝工程手段來增強或減弱某個體內生化反應的活性，需要對編碼該酶的關鍵基因進行分子改造才有顯著效果。否則，改造后效果也不會顯著。

發明內容

本發明就是為了解決現有菌株生產長鏈二元酸效果不顯著的技術問題，提供一種生產效率高的長鏈二元酸生產菌株及其制備方法和應用。

為此，本發明提供一種長鏈二元酸生產菌株，其分類命名為假絲酵母菌(Candida sp.)TDTC027，所述菌株于2014年3月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；其保藏編號為：CGMCC No.8931。

本發明中，長鏈二元酸生產菌株過氧化氫酶等位基因CandidaA05093或CandidaA09561的啟動子已被強啟動子替換，過氧化氫酶等位基因的堿基序列分別如序列表中的序列8和序列9所示，過氧化氫酶基因為該菌株基因組中編碼該酶的多個基因中對于長鏈二元酸生產最為關鍵一個。

本發明同時提供一種長鏈二元酸生產菌株的制備方法，其包括如下步驟：(1)準備引物Pro1、Pro2、Pro3和Pro-4；(2)準備長鏈二元酸生產菌感受態細胞，長鏈二元酸生產菌株為假絲酵母(Candida sp.)DC12；(3)使用步驟(1)中的引物進行擴增分別得到篩選標記Sat1基因片段(引物Pro1和Pro2)和強啟動子片段(引物Pro3和Pro4)，再經過一輪重疊PCR將兩個片段連接起來，再將此重疊PCR擴增的產物通過同源重組替換過氧化氫酶等位基因的原始啟動子，達到增強過氧化氫酶基因表達的目的，所述的過氧化氫酶等位基因的堿基序列如序列表中的序列8和序列9所示；(4)通過PCR擴增、純化、電轉、篩選、鑒定，得到本發明的長鏈二元酸生產菌株。

優選地，本發明中長鏈二元酸生產菌株的制備方法，篩選步驟中使用的篩選標記為clonNAT抗性。

優選地，長鏈二元酸生產菌株的制備方法，步驟(2)中的。

本發明同時提供長鏈二元酸生產菌株在生產長鏈二元酸中的應用。