[發明專利]一種誘導DC細胞成熟的苦蕎提取物、培養基及誘導方法

在審

• 申請號: 201410172941.3
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN104151413A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 白崇智;王轉花;李玉英;崔曉東
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C07K14/42
• 分類號: C07K14/42;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C12N5/0784
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及植物提取物領域，特別涉及免疫調節相關的DC細胞誘導領域?

背景技術

樹突狀細胞(Dendritic?cells，DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen?presenting?cells，APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。DC與腫瘤的發生、發展有著密切關系，大部分實體瘤內浸潤的DC數量多則患者預后好。有效的抗腫瘤免疫反應的核心是產生以CD8⁺T細胞為主體的細胞免疫應答，這也是DC作為免疫治療手段的基礎。?

《本草綱目》記載：苦蕎麥味苦，性平寒，益氣力，續精神，利耳目，有降氣寬腸健胃的作用。現代臨床醫學觀察表明，苦蕎麥粉及其制品具有降血糖、降血脂，增強人體免疫力的作用，對糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、中風等病人都有輔助治療作用。從苦蕎中提純活性物質，以便使其作用最大化，成為近來研究方向。?

發明內容

本發明涉及一種本發明意外發現的能夠誘導DC成熟的苦蕎提取物及其提取方法，和利用該苦蕎提取物制備的其誘導DC成熟的專用培養基、誘導方法，以及一種利用其制備的免疫增強劑。?

具體而言，本發明涉及以苦蕎麥(拉丁名Fagopyrum?tataricum，蓼科，蕎麥屬)特別是山西苦蕎黑風一號種子(山西省農科院種子資源所提供)為原料，?提取、分離、純化得到的一種具有凝集素活性的苦蕎蛋白質類制品及其誘導DC成熟的專用培養基制備方法。?

在一個實施方式中，本發明提供了一種苦蕎提取物的提取方法，包括：提取苦蕎種子所含蛋白質；Resource?Q陰離子交換層析；和Sephadex?G75凝膠過濾層析，獲得包含分子量約60～65kD的蛋白質的層析餾分，所述層析餾分為所述苦蕎提取物。?

在一個優選的實施方式中，其中所述苦蕎種子為山西苦蕎黑風一號的種子。?

在一個實施方式中，其中所述提取苦蕎種子所含蛋白質的步驟包括：將烘干的所述苦蕎種子脫殼粉碎；將粉碎后的所述苦蕎種子用醋酸鹽緩沖液在4℃下抽提；離心除去沉淀；將離心后的上清液用硫酸銨沉淀，優選使得硫酸銨的飽和度達到80％；和將得到的沉淀用緩沖液溶解后透析，得到所述苦蕎種子所含蛋白質。?

本發明還提供了一種由上述方法獲得的苦蕎提取物，所述植物凝集素包含如上所述的苦蕎提取物。所述苦蕎提取物優選具有凝集素活性。優選地，所述凝集素為所述分子量約60～65kD的蛋白質。?

本發明還提供了一種誘導樹突狀細胞成熟的培養基，包含上述苦蕎提取物或植物凝集素。?

該培養基可進一步包含RPMI-1640培養基、rhIL-4、rhGM-CSF和胎牛血清。?

在一個優選實施方式中，其中在所述培養基中所述苦蕎提取物中分子量為60～65kD的蛋白質的終濃度為45～55μg/mL，優選50μg/mL。?

本發明還提供了一種誘導樹突狀細胞成熟的方法，所述方法包括用上述誘導樹突狀細胞成熟的培養基誘導培養2～3天，優選2天。?

在用所述誘導樹突狀細胞成熟的培養基培養之前，進一步包括：?

在含10％FCS的RPMI-1640培養基中加入含DC的外周血單個核細胞和誘導因子rhIL-4和rhGM-CSF，培養到第7～8天，優選第7天時使用所述誘導樹?突狀細胞成熟的培養基。?

本發明建立了成熟、穩定的誘導DC成熟的培養體系，所需的細胞因子少，且DC成熟度高，表面標志物提升明顯。本發明為進一步開發樹突狀細胞疫苗提供了新型有效的途徑。?

本發明還提供了一種DC疫苗增強劑，包括上述苦蕎提取物或植物凝集素，優選進一步包括rhIL-4和rhGM-CSF。本發明的苦蕎提取物通過誘導DC細胞成熟并促進成熟DC細胞增殖，不僅僅能夠由于科學研究中作為誘導試劑使用，還能夠調節人體免疫功能，進而起到改善物質代謝、增強抗應激功能、延緩衰老等作用，從而可用于保健品。?

另外，本發明的苦蕎提取物還可通過誘導DC成熟，提高DC疫苗的效率和細胞免疫效果，來作為DC疫苗的增強劑。?

附圖說明

圖1為純化條件圖；?

圖2為本發明制備的苦蕎凝集素的SDS-PAGE分析圖，其中：?

泳道1：Mr：低分子量標準蛋白；泳道2：Resource?Q純化收集物，收集的Peak?II；泳道3：Sephadex?G75凝膠柱純化的凝集素，收集的Peak?IV；?