[發明專利]一種構建工程化脂肪的方法

無效

• 申請號: 201410168071.2
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN103920189A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 劉毅;薛美思;唐軍;李世龍
• 申請（專利權）人: 劉毅
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/22;A61L27/20;A61L27/18;A61L27/54;C12N5/0775
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

1.一種構建工程化脂肪的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)構建攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒；

(b)將所述攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒轉染人臍帶間充質干細胞，得到轉染人胰島素的人臍帶間充質干細胞；

(c)將所述轉染人胰島素的人臍帶間充質干細胞與支架復合培養，得到人臍帶間充質干細胞-支架復合物；

(d)將所述人臍帶間充質干細胞-支架復合物移植到體內。

2.根據權利要求1所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(a)中，所述構建攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒包括以下步驟：

合成人胰島素基因序列，對其擴增后測序；

將測序正確的人胰島素基因與pLenti6.3-IRES-EGFP載體連接，得到慢病毒表達載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP；

將所述慢病毒表達載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP轉入DH5α感受態細胞，篩選出陽性克隆體；

對所述陽性克隆體進行培養繁殖，提取陽性克隆體的質粒；

將所述陽性克隆體的質粒轉染至細胞293T，得到攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒。

3.根據權利要求1所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，將所述攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒轉染人臍帶間充質干細胞前，檢測所述人臍帶間充質干細胞表面抗原，所述表面抗原包括CD13、CD14、CD34、CD44及CD3。

4.根據權利要求1所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，將所述攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒轉染人臍帶間充質干細胞前，檢測人臍帶間充質干細胞向脂肪細胞誘導分化的能力。

5.根據權利要求4所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，所述檢測人臍帶間充質干細胞向脂肪細胞誘導分化的能力采用觀察脂肪滴形成的情況進行鑒定。

6.根據權利要求4所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，將所述攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒轉染人臍帶間充質干細胞前，檢測人臍帶間充質干細胞向成骨細胞誘導分化的能力。

7.根據權利要求6所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，將所述攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒轉染人臍帶間充質干細胞具體為：

將不同感染復數的慢病毒顆粒感染293T細胞，篩選出最適感染復數；

將人臍帶間充質干細胞以4-6×10⁵個/孔接種于6孔培養板中，培養8-16h，在LG-DMEM培養基中加入終濃度為7-9mg/L的聚凝胺后，加入最適感染復數的慢病毒顆粒；

所述慢病毒顆粒加入5-7h后，將所述LG-DMEM培養基更換為不含聚凝胺的LG-DMEM培養基，然后放置在36-38℃、體積分數4.5-5.5％CO₂的培養箱中培養；所述慢病毒顆粒加入70-75h后收集細胞，得到攜帶人胰島素的重組慢病毒顆粒轉染人臍帶間充質干細胞。

8.根據權利要求1所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(c)中，所述支架為絲素蛋白支架、透明質酸衍生酯海綿支架和聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架中的任一種。

9.根據權利要求8所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步驟(c)中，在所述復合培養前，將所述支架剪切成0.9-1.1cm×0.9-1.1cm×0.15-0.25cm大小，置于蒸餾水中，用γ射線滅菌，輻射劑量為10kGy；

將滅菌后的所述支架在超凈臺內用LG-DMEM細胞培養液浸泡24h，更換培養液2-4次，得到處理后的支架。

10.根據權利要求9所述的構建工程化脂肪的方法，其特征在于，所述步驟(c)具體為：取所述轉染人胰島素的人臍帶間充質干細胞的細胞濃度為2-5×10⁶個/ml的細胞懸液100μl，滴在所述支架上，然后放置于36-38℃CO₂恒溫培養箱內3-4h；添加LG-DMEM培養基完全淹沒細胞和所述支架，置于36-38℃CO₂恒溫培養箱內培養，22-26h后更換為成脂誘導劑，培養5-7d，得到所述人臍帶間充質干細胞-支架復合物。