[發(fā)明專利]一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410160278.5
• 申請日: 2014-04-21
• 公開（公告）號: CN103966257A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏蘭琴;王根平;杜文明;孫永偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于獲得無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是進(jìn)行基因功能研究和通過基因工程進(jìn)行植物遺傳改良的重要工具。自1996年首例轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，目前世界各國已累計(jì)批準(zhǔn)23種轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，涉及13類目標(biāo)性狀，包括抗蟲、抗除草劑、抗病、育性改變、品質(zhì)改良等。以抗除草劑和抗蟲為主的大豆、玉米、棉花、油菜等轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)在全球22個國家和地區(qū)種植，2012年種植面積已達(dá)1.7億公頃。轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化已成為全球新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)，是增強(qiáng)農(nóng)業(yè)國際競爭力的重要保障。

目前植物遺傳轉(zhuǎn)化方法眾多，其中根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediated transformation)和基因槍轟擊法(particle bombardment transformation)是植物遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法外源基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)化機(jī)理清楚、整合位點(diǎn)較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異較小、遺傳穩(wěn)定性好，但存在受體基因型限制和骨架序列整合的缺點(diǎn)；基因槍轉(zhuǎn)化法基本不受材料基因型的限制，但卻存在轉(zhuǎn)基因植株中整合有載體骨架序列和抗生素標(biāo)記、目的基因的多拷貝、轉(zhuǎn)基因沉默以及轉(zhuǎn)基因后代遺傳穩(wěn)定性差等問題。

盡管多數(shù)國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的態(tài)度日趨積極，但轉(zhuǎn)基因作物的潛在安全風(fēng)險問題仍然受到公眾的普遍關(guān)注，特別在歐洲一些國家轉(zhuǎn)基因作物的爭議非常激烈。在轉(zhuǎn)基因作物中爭議最大的是抗除草劑和抗生素類選擇標(biāo)記可能帶來的潛在風(fēng)險。如在環(huán)境方面，由于花粉飄移可能形成超級雜草、增加靶標(biāo)生物抗性、對生物多樣性影響等。在食品安全方面，包括標(biāo)記基因所表達(dá)蛋白質(zhì)致敏性，以及對受體作物本身營養(yǎng)成分、天然毒素和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量等方面的影響及其它可能的非預(yù)期效應(yīng)。另外標(biāo)記基因的存在也不利于基因的重復(fù)轉(zhuǎn)化。因此建立安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系和培育無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)的主要方向，也是各國在轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新的熱點(diǎn)之一。

雙元載體的發(fā)展和Gateway克隆技術(shù)的應(yīng)用大大促進(jìn)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在植物基因工程改良中的應(yīng)用，同時也使其成為獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的重要工具。從1983年Hoekema等把根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir區(qū)和T-DNA區(qū)分離并置于兩個復(fù)制子中，提出雙元載體策略以來，雙元載體的發(fā)展已取得了突破性的進(jìn)展。雙元載體的種類從最早pBin19和pBI121的構(gòu)建至今二十幾年間，已發(fā)展了二十多個系列幾十種載體，如：pCAMBIA，pMDC和pGreen雙元載體系列等。與此同時，雙元載體在以下幾個方面得到了大幅度的優(yōu)化：添加廣適的復(fù)起制點(diǎn)，使其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中能夠自由復(fù)制；運(yùn)用高拷貝復(fù)制子，以提高質(zhì)粒的產(chǎn)量，便于體外亞克隆操作；降低載體質(zhì)粒的長度和增加T-DNA內(nèi)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，便于外源基因的亞克隆操作。在提高轉(zhuǎn)化效率和增強(qiáng)外源基因表達(dá)穩(wěn)定性方面，通過添加額外的vir基因、T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)序列（overdrive）、基因沉默抑制子等方面的改良，提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率和外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。雙元載體的發(fā)展，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物基因研究的各個領(lǐng)域，如RNA干擾、基因過表達(dá)、多基因傳遞、功能基因組和蛋白質(zhì)組研究等。然而通過傳統(tǒng)的酶切、連接方法構(gòu)建不同用途的載體，不僅耗時耗力， 而且還受到酶切位點(diǎn)的限制，特別是對于高通量的功能基因組和蛋白質(zhì)組研究來說，載體構(gòu)建是一個最大的‘瓶頸’。Gateway技術(shù)的出現(xiàn)，克服了傳統(tǒng)載體構(gòu)建中遇到的上述問題。

Gateway克隆技術(shù)是Invitrogen公司基于λ噬菌體介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性整合和刪除系統(tǒng)而開發(fā)的。位于特異性位點(diǎn)att間的DNA片段，在重組酶BP Clonase或LR Clonase Enzyme Mix的作用下，通過一步反應(yīng)（attB×attP或attL×attR)便可將DNA片段轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)重組位點(diǎn)的目的載體中，避免了載體構(gòu)建中的酶切、連接等繁瑣步驟。目前已報(bào)道了多種Gateway兼容的雙元載體，如pW、pMDC、pEarleyGate系列載體，每種載體系列都含有多種不同用途的載體類型。如pW系列載體包括過表達(dá)和反義表達(dá)載體、用于啟動子分析含有LUC、GUS和GFP-GUS等基因的載體、用于基因融合的含GFP基因的載體和用于基因沉默的RNA干擾載體。