[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410157802.3
• 申請(qǐng)日: 2014-04-18
• 公開（公告）號(hào): CN103881953A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙景坤;徐振達(dá);喬凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱方依達(dá)肥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

人們對(duì)枯草芽孢桿菌生防潛能的研究已經(jīng)有很多年了，田間應(yīng)用研究已經(jīng)證實(shí)枯草芽孢桿菌菌劑在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性枯草芽孢桿菌是生物防治中報(bào)道較多的一種拮抗細(xì)菌，在植物病害的生物防治中發(fā)揮尤為重要的作用。在土地中代謝產(chǎn)生光譜抗菌性物質(zhì)，形成優(yōu)勢(shì)菌群，有抗逆能力和抗菌防毒作用，目前有很多人已經(jīng)分離出很好的優(yōu)良菌株用于植物生長(zhǎng)防病上。現(xiàn)有的發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌的工序的復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法。本發(fā)明在發(fā)酵過(guò)程中可以根據(jù)用量進(jìn)行連續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)菌種，不需要每個(gè)批次都進(jìn)行種子的培養(yǎng)，減少生產(chǎn)工序，降低生產(chǎn)成本。

本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種枯草芽孢桿菌的連續(xù)發(fā)酵方法，本方法在無(wú)菌條件下進(jìn)行，方法如下：將枯草芽孢桿菌種子液按照0.5-5％的接種量加入到含有體積百分?jǐn)?shù)70％培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，在34-37℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm，通氣量0.2-1vvm，pH＝6-9，培養(yǎng)32-40小時(shí)；然后將發(fā)酵后的培養(yǎng)液在600nm的分光度計(jì)下測(cè)量值為8-9，鏡檢視野中90％以上呈現(xiàn)芽孢狀時(shí)，通過(guò)流加和導(dǎo)出裝置，每小時(shí)導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的3-5％，再補(bǔ)充相同量新的培養(yǎng)液，連續(xù)操作70-80小時(shí)；導(dǎo)出的發(fā)酵液即為枯草芽孢桿菌的液體菌懸液；

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

1、所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下：玉米粉2-3％，酵母粉0.2-0.4％，蛋白胨0.2-0.4％，硫酸銨0.3-0.4％，磷酸二氫鉀0.25-0.35％，磷酸氫二鉀0.6-0.8％，pH＝7.0-7.5。

2、所述的培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為發(fā)酵36小時(shí)后開始進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果為：發(fā)酵過(guò)程中僅需要一次種子培養(yǎng)，減少了生產(chǎn)的工序，同等時(shí)間產(chǎn)出的發(fā)酵液多于單批次發(fā)酵，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明所述的發(fā)酵形式可用于連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)和批次發(fā)酵培養(yǎng)，適用于帶有機(jī)械攪拌的液體發(fā)酵容器。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例都在無(wú)菌條件下進(jìn)行：

實(shí)施例1

菌種：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCC11088；

菌種活化：將凍干管保存的菌種接種到牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基上，在氣浴要床上轉(zhuǎn)速150-200rpm，溫度28-32℃下培養(yǎng)20-24小時(shí)；取0.1ml溶液按照涂平板的方法均勻平鋪到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中在溫度28-32℃下培養(yǎng)20-24小時(shí)，作為一代菌種使用；在上述平板中挑取單菌落到LB斜面培養(yǎng)基中在溫度28-32℃下培養(yǎng)20-24小時(shí)，備用；

種子液的制備：取一接種環(huán)在LB培養(yǎng)基上活化好的菌種接種到裝液量為100ml種子培養(yǎng)基的500m1三角瓶中，28-32℃，搖床轉(zhuǎn)速150-200rpm下培養(yǎng)16-20小時(shí)，所得即為枯草芽孢桿菌液體種子液；

上述的種子液配方為，按質(zhì)量百分含量：玉米漿2-4％，蛋白胨0.5-1.5％，葡萄糖2-3％，磷酸二氫鉀0.5-0.6％，磷酸氫二鉀1-2％，pH7.0-7.5；

實(shí)施例2

(1)發(fā)酵方式：5L發(fā)酵罐，連續(xù)流加發(fā)酵；

(2)發(fā)酵過(guò)程：將實(shí)施例1制得的種子液按照0.5％的接種量，接種到含有體積百分?jǐn)?shù)70％培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵控制溫度為34℃，pH＝6，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為1vvm，培養(yǎng)到40小時(shí)，檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)在600nm的分光度計(jì)下測(cè)量值為8.17，鏡檢視野中90％以上呈現(xiàn)芽孢狀時(shí)，通過(guò)發(fā)酵罐的流加和導(dǎo)出裝置，每小時(shí)導(dǎo)出發(fā)酵后的培養(yǎng)液體積比的3％先導(dǎo)出，后流加補(bǔ)足已滅好菌的新的培養(yǎng)液。此時(shí)需要開始需要每小時(shí)取樣，檢測(cè)在指標(biāo)范圍內(nèi)即可導(dǎo)出和流加發(fā)酵液，持續(xù)70小時(shí)；本發(fā)明產(chǎn)生的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)菌和液分離，減壓低溫烘干菌粉。

所述的培養(yǎng)液按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)配比如下：玉米粉3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.4％，硫酸銨0.3，磷酸二氫鉀，0.3％，磷酸氫二鉀0.6％，pH＝7.0-7.5；

(3)發(fā)酵結(jié)果：最終發(fā)酵液在600nm的分光度計(jì)下測(cè)量值為8.17，鏡檢結(jié)果超過(guò)90％呈現(xiàn)芽孢狀，在制作成菌劑測(cè)得菌數(shù)102億CFU/克，最終產(chǎn)生發(fā)酵液的數(shù)量為13.58升，比較等同時(shí)間單批次發(fā)酵約為10.5升有很大的提高。證明此方法可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。