[發明專利]一種CDKN2A基因片段及其引物以及在腫瘤診斷中的應用

在審

• 申請號: 201610237251.0
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105779465A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 蔡春;葉曉霞;張立堅;黃瓊林;張俊杰;文娟
• 申請（專利權）人: 廣東醫學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 張文雄

技術領域

本發明屬于基因技術領域，具體涉及CDKN2A基因片段在腫瘤的臨床診斷、療效 監測及預后判斷領域的應用。

背景技術

腫瘤(tumor)是一類常見病、多發病，目前，惡性腫瘤已成為危害人類健康最嚴 重的疾病之一。惡性腫瘤的死亡率僅次于心血管系統疾病而居第二位，并呈逐漸上升的 趨勢，耗費大量的醫療資源。大部分腫瘤是由基因突變和表觀遺傳學改變的逐漸積累、 共同作用引起的，其發展緩慢，如果能在早期發現，可以進行手術切除與根治，因而腫 瘤的早期篩查意義非常重大。現有篩查腫瘤的方法有結腸鏡檢查、糞便sDNA檢查、血 清癌胚抗原(CEA)水平檢查等，然而其診斷效率、準確性或侵入性等不甚令人滿意， 仍有一半的腫瘤患者在晚期才被發現。尋找腫瘤生物標志物，應用于早期診斷與篩查， 對腫瘤患者診斷及預后都有重要的意義。

CDKN2A是人類各種腫瘤中失活頻率最高的腫瘤抑制基因。CDKN2A蛋白為細胞 周期素依賴激酶(CDK)抑制物(CDKinhibitor,CKI)，可與CyclinD1競爭性結合CDK4， 而特異地抑制CDK4的活性，使Rb基因蛋白磷酸化，最終阻止細胞生長分裂。如果 CDKN2A基因失去正常表達時，將使CDKN2A蛋白無活性或蛋白產物缺乏，細胞不斷 增值，從而導致腫瘤的發生發展。現有研究表明，CDKN2A基因失活主要源于基因發 生甲基化而沉默，CDKN2A基因的甲基化與腫瘤的發生發展具有密切關系。因此，檢 測CDKN2A基因甲基化對腫瘤的早期診斷、預后等都有重要作用。

但是，目前尚未確定合適的CDKN2A基因片段，可以通過測定其甲基化水平，用 于作為腫瘤診斷、療效監測及預后判斷的生物標志物。因此，有必要在這方面進行進一 步的研究，設計合理的上下游引物，定位可以測定其甲基化水平的合適的CDKN2A基 因片段。

發明內容

本發明公開了一種CDKN2A基因片段及其引物以及在腫瘤診斷中的應用，通過該 基因片段的DNA甲基化的水平改變，跟蹤腫瘤的發生發展，為腫瘤的診斷、療效監測 及預后改善判斷提供一種新的生物標志物。

為了實現上述發明目的，本發明的具體內容如下：

一種CDKN2A基因片段，為人類CDKN2A基因外顯子2上的一段DNA序列，長 度為273bp，包含32個CpG位點，所述CDKN2A基因片段的序列如下所示：

上述CDKN2A基因片段設計的特異性引物，具體如下：

上游引物CDKN2A-f：5'-GGTCATGATGATGGGCAG-3'

下游引物CDKN2A-r：5'-TTACTACCTCTAATACCCC-3'

基于披露的上述內容，本發明還包括上述CDKN2A基因片段在腫瘤診斷中的應用。

上述CDKN2A基因片段在腫瘤診斷的試劑盒中的應用。

上述CDKN2A基因片段引物在腫瘤診斷中的應用。

上述CDKN2A基因片段引物在腫瘤的診斷試劑盒中的應用。

本發明的意義在于設計了上述上下游引物對，確定了上述特定的CDKN2A基因片 段，該基因片段在腫瘤患者中呈現顯著的高DNA甲基化，而在正常人中DNA甲基化較 低，兩者具有統計學差異，因而可以用于腫瘤及早診斷、療效監測及預后判斷，其甲基 化水平的測定方法包括質譜、光譜、電化學或PCR技術。

本發明的有益效果在于，所公開的CDKN2A基因片段小，僅273bp，采用本發明提 供的引物和程序，只需一次PCR即可擴增成功，不僅易于操作、節省時間，也可大大降 低成本。本發明所述的CDKN2A基因片段可以從血液、組織、細胞、體液、排泄物類型 的樣品中獲得，取樣簡便，適用范圍廣。因此，本發明提供的CDKN2A基因片段作為腫 瘤診斷、治療效果和預后改善的臨床指標，對于腫瘤的篩查和診斷，具有非常重大的意 義。

附圖說明

圖1腫瘤和正常血液CDKN2A基因片段的PCR擴增

其中：M.DNAmarker；1-6腫瘤血液；7-12正常血液