[發明專利]一種特異識別Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4?2的序列和應用

有效

• 申請號: 201410143206.X
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN104450712B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 邵寧生;李少華;李慧;王瑋;丁紅梅;李潔;黃皚雪;趙強
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
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發明領域：

本發明涉及特異識別Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基V4-2的序列和修飾，以及修飾后的V4-2在識別Vasorin(VASN)蛋白方面的應用。本發明涉及V4-2在生物醫藥方面的應用。V4-2作為試劑盒的組成部分或者檢測指標，用于肝癌的輔助診斷或者進行肝癌疾病發生、發展、進程相關的基礎研究等。V4-2作為載體遞送藥物靶向肝癌細胞方面的應用。

背景技術：

指數富集的配基系統進化技術，簡稱SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)技術，是近十幾年興起并迅速得到發展的高通量生物文庫篩選技術。應用大容量的隨機寡核苷酸文庫(ssDNA文庫和RNA文庫)，結合PCR體外擴增技術，以指數級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過反復的體外篩選、擴增，最終獲得的寡核苷酸配基(aptamer)基于空間結構與靶分子呈高特異性和高親和力的結合。由于aptamer具有精確識別、無免疫原性、易體外合成與修飾等優點，又稱為“人工替代抗體”，在基礎醫學、臨床診斷與新藥研發等方面具有廣闊的應用前景。尤其是近年來興起的復合靶SELEX技術，使得對未知靶分子進行篩選成為可能，并且通過引入消減篩選步驟，能夠獲得特異識別兩組復合靶子中差異存在分子的aptamer，并能利用該配基反過來對差異靶分子進行研究，這就為開發新型分子探針以及鑒定生物標志物，尤其是腫瘤標志物分子開辟了新的途徑。

我們從伴肝外轉移的AFP陰性HCC患者血清中鑒定出一個與正常血清成分差異的蛋白，Vasorin(VASN)蛋白。有研究發現，VASN通過與TGF-β結合阻斷TGF-β信號通路，參與新生血管形成。其相似蛋白SLIT蛋白在多種實體瘤中高表達，參與腫瘤誘導的新生血管形成和促進腫瘤細胞的增殖與抗凋亡，與腫瘤的惡性程度相關。最新的一篇文獻證實，VASN在人膠質母細胞瘤中高表達，它作為HIF-1的靶子，能夠抑制TNFα和低氧誘導的細胞凋亡，有可能作為人膠質母細胞瘤的潛在診斷標志物或藥物治療靶標。應用分泌蛋白組學的方法分析藥物治療前后對人甲狀腺癌細胞株TPC-1分泌蛋白的影響，發現VASN蛋白水平在治療后下降。

本發明是通過SELEX技術獲得了一個寡核苷酸配基V4-2。經鑒定，V4-2能夠特異識別Vasorin(VASN)蛋白，而不結合其他蛋白，對照核酸序列與上述蛋白均無結合，目前尚未見能特異結合Vasorin(VASN)蛋白的核酸適配體的相關研究報道。

發明內容：

本發明目的在于提出特異識別Vasorin(VASN)蛋白的寡核苷酸配基VA-2的序列及其應用領域，包括V4-2作為試劑盒的組成部分或者檢測指標，用于肝癌的輔助診斷或者進行肝癌疾病發生、發展、進程相關的基礎研究等。V4-2作為載體遞送藥物靶向肝癌細胞方面的應用。本發明通過以下技術方案實現：

首先由Invitrogen公司合成V4-2序列，并在5’端或3’端修飾、標記(如FITC、生物素或者同位素)，然后進行應用研究：組織化學或熒光方法檢測V4-2識別Vasorin(VASN)蛋白。

本發明優點：

1)與蛋白類的抗體相比，單鏈的寡核苷酸更加穩定；aptamer可直接體外合成、標記，因此不需要標記的二抗，使得操作更為簡單、迅速；aptamer的合成成本較抗體制備成本低，周期短。

2)本發明證實V4-2能夠特異識別Vasorin(VASN)蛋白。因此，V4-2序列在臨床醫學與基礎醫學的腫瘤研究相關領域中均具有廣泛的應用價值和廣闊的市場前景。

附圖說明：

圖1EMSA實驗證實V4-2所結合的靶蛋白為Vasorin(VASN)蛋白。

圖2ELISA實驗證實V4-2所結合的靶蛋白為Vasorin(VASN)蛋白。

具體實施方式：

下面通過V4-2對Vasorin(VASN)蛋白的識別來進一步描述本發明。

本發明通過以下技術方案實現：

1.通過同位素以及生物素標記的V4-2對Vasorin(VASN)蛋白的特異識別來進一步描述本發明。

1.1合成V4-2(序列表中SEQ ID No.1)、GP35(序列表中SEQ ID No.2)和GP45(序列表中SEQ ID No.3)序列，通過置換反應使V4-2、GP35和GP45的5’端標記上γ-³²P-ATP。

γ-³²P-V4-2：