[發明專利]一種檢測肉牛A-FABP基因單核苷酸多態性的方法

有效

• 申請號: 201410142764.4
• 申請日: 2014-04-11
• 公開（公告）號: CN103911450A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 甘乾福;喬慧;梁學武;陳佳欽
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于分子遺傳學領域，涉及一種檢測肉牛A-FABP基因單核苷酸多態性的方法，以牛的肉用性狀基因的單核苷酸多態性（SNP）作為分子遺傳標記，特別涉及牛的A-FABP（脂肪型脂肪酸結合蛋白）基因的單核苷酸多態性位點及其應用。

背景技術

隨著經濟的發展，人們對于牛肉的數量和品質要求日益提高。雖然我國已成為第三大養牛與牛肉生產國，但是高檔大部分依賴于進口。因此提高肉用性能勢在必行，途徑主要有改善飼料營養，加強飼養管理水平和培育優良品種等，而良種是肉牛業發展的先決條件和物質基礎。人們在了解肉用性狀的遺傳規律和相應的生長發育、脂肪沉積等生命活動調控規律的基礎上，結合分子生物學方面的研究，發現了與肉用性狀有密切聯系的功能基因和主效基因以及和這些基因連鎖的分子遺傳標記，根據目標性狀與候選基因基因型間的關聯性進行選擇，提高了育種方向的準確性，縮短了育種年限。

?單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous?cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous?cSNP)，指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。

??分子生物學的發展為分子標記輔助選擇提供了理論基礎和技術支持，通過檢測功能基因某位點的多態性，對不同基因型個體與其生產性能進行關聯分析，找出優勢基因型和優勢等位基因，為選種提供依據，這一過程中檢測多態性和基因分型的準確是很關鍵的。目前主要的方法有PCR-RFLP技術或PCR-SSCP技術結合DNA測序。

??A-FABP基因編碼脂肪型脂肪酸結合蛋白，在脂肪細胞中高度表達，牛A-FABP基因能通過調控激素敏感酯酶HSL的功能，在脂質水解和細胞內脂肪酸轉運中發揮關鍵作用。同時，脂肪型脂肪酸結合蛋白可在細胞內與脂肪酸結合，造成細胞內外脂肪酸濃度差，從而促進細胞攝取脂肪酸，并能在脂肪細胞中沉積甘油三酯，提高肌內脂肪含量。而隨著肌內脂肪含量的增加，肉的嫩度、風味、多汁性等都得到了改善，大理石紋評分更加理想，提高了牛肉的品質。

發明內容

本發明的目的在于提供一種牛A-FABP基因SNP的篩查和檢測方法，本發明解決的問題在于利用PCR產物混合測序的方法篩查牛A-FABP基因的多態性位點。通過關聯分析尋找與牛肉質性狀相關的SNP作為分子標記，以功能SNP作為牛分子育種和輔助選擇的標記，加快良種選育速度和提高種群品質。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明根據A-FABP基因的外顯子設計引物，分別以8種牛品種的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，對PCR產物混合并純化，測序后得到牛A-FABP的部分序列。

一種用于檢測肉牛A-FABP基因單核苷酸多態性的引物，所述的引物對P1為：正向引物F:5'-AGGCGTGGGCTTTGCTAC-3'；反向引物R:5'-GAATGGCTTTCCTCCTTCTACA-3'。

一種檢測肉牛A-FABP基因單核苷酸多態性的方法，包括以下步驟：

⑴?以包含A-FABP基因的待測牛基因組DNA為模版，以引物對P1為引物，PCR擴增牛A-FABP基因；

⑵?對步驟⑴的擴增產物進行PCR目的片段檢測；

⑶?對步驟⑵的目的片段進行PCR-SSCP檢測：首先對目的片段分別用變性劑進行變性處理，然后根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果判定其多態性位點。

所述多態性位點包括：在牛的A-FABP基因第2989位為A或G的堿基多態性位點，表現為AA、AG、GG三種基因型。

所述的PCR擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s；60℃退火40s；72℃延伸30s；72℃延伸7min；4℃保存。

所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。