[發明專利]一例大鼠胰島上皮樣干細胞系

在審

• 申請號: 201410138844.2
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103881961A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 安立龍;效梅
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

技術領域

本發明涉及人類和其它哺乳動物胰島干細胞系及其特征，特別涉及一例大鼠胰島上皮樣干細胞系及其形態、生長、表達和分化等特征，屬于動物細胞（組織）工程領域。

背景技術

糖尿病（Diabetes?mellitus，DM）是危害人類健康的重大疾病之一，據統計目前全世界糖尿病患者已達3.46億(Am?J?Stem?Cells.2012,1(3):196-204.)，而傳統的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫治該病。近十年來，隨著移植技術的發展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效（N?Engl?J?Med.2000,343(4):230-238.?Diabetes.2005,54(7):2060-2069.?Am?J?Transplant.2008,8(11):2463-2470.?Immune?Netw.?2013,13(6):235-239.）。但是，由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術的應用受到制約。胰島干細胞是存在于胰腺內分泌組織胰島中的成體干細胞，能自我更新并具有多分化潛能。體外分離克隆胰島干細胞，誘導其分化形成功能性胰島，并移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰島干細胞系，研究胰島干細胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點。國外，Zulewski等（Diabetes.2001,50(3):521-533.Endocrinology.2002,143(8):3152-3161.StemCells.?2004,22(7):1134-1141.）首先報道膠原酶消化大鼠或成人胰腺組織分離獲得單個細胞和胰島，RPMI1640培養液懸浮培養，96h后，挑出懸浮胰島，培養液中再添加20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF貼壁培養，上皮樣胰島干細胞克隆性生長。其中，大鼠胰島干細胞8.5個月擴增了10倍，人胰島干細胞8個月擴增了7倍。免疫化學反應顯示胰島干細胞表達巢蛋白（nestin），不表達insulin、glucagon、somatostatin和CK19。體外定向誘導，胰島干細胞分化形成胰腺導管細胞，表達CK19；分化形成胰島細胞，表達insulin、glucagon等；分化形成肝臟細胞，表達α-甲胎蛋白；分化形成神經細胞，表達神經細胞特異性粘附分子。移植在小鼠肝臟內，人源性胰島干細胞分化形成人肝臟細胞。Maria-Engler等（J?Endocrinol.2004,183(3):455-467.）膠原酶HI灌注消化成人胰腺主胰管，分離獲得細胞和細胞團，密度梯度離心，雙硫腙（dithizon，DTZ）活性染色檢測，篩選出直徑大于150μm胰島，CMRL1066+10%FCS培養。共聚焦熒光顯微觀察和RT-PCR檢測，培養24h，胰島細胞團中僅有少量細胞表達nestin；培養60d，nestin⁺表達量顯著增多。采用含10%FBS培養液培養nestin⁺細胞30d，表達insulin；而采用含1%FBS培養液培養nestin⁺細胞30d，則表達insulin、glucagon和somatostatin。因此，作者認為體外長期培養，人胰島中的nestin⁺細胞具有干細胞特性。Humphrey等（Diabetes.?2003,52(10):2519-2525.）膠原酶消化人胎兒早期胰腺組織獲得胰島細胞團，貼壁培養，上皮樣細胞擴增形成單層。構建nestin-GFP質粒，腺病毒轉染，418篩選，純化出nestin⁺細胞。RT-PCR檢測nestin⁺細胞共表達波形蛋白。采用煙酰胺、HGF等體外定向誘導，nestin⁺細胞卻不能分化形成表達Pdx1、insulin的β細胞，移植在無胸腺小鼠體內也不能分化形成功能性β細胞，分泌insulin。這表明nestin不是β細胞祖細胞的特異性標記物。Sugiyama等（Proc?Natl?Acad?Sci?USA.2007,?104(1):175-180.）胰蛋白酶消化小鼠胎兒胰腺組織，分離獲得單個細胞。流式細胞術分選，獲得共表達Ngn3、CD133和CD45f的胰島干細胞。體外定向誘導，胰島干細胞分化形成β細胞，分泌insulin。Ta等（Stem?Cells.2006,24(7):1738-1749.）的研究表明在培養液中添加成纖維細胞生長因子（basic?fibroblast?growth?facter,?bFGF）、白細胞抑制因子（leukemia?inhibitory?factor,?LIF）和骨形態發生蛋白4（bone?morphogenetic?protein-4,?BMP4），均能促進成年小鼠胰島干細胞擴增。Jin等（Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A.?2013,110(10):3907-?3912.）膠原酶B+DNase消化液消化成年小鼠胰腺組織獲得單個細胞，CD133標記，流式細胞術分選，條件培養基培養，3w后，細胞克隆形成細胞團，RT-PCR檢測克隆細胞表達CD133。培養液中添加RSPO1定向誘導，CD133⁺細胞分化形成表達Ngn3的胰島干細胞和腺泡細胞。流式細胞術進一步分選出Ngn3⁺胰島干細胞，體外定向誘導，分化形成β細胞。葡萄糖刺激，分泌insulin。國內，效梅等（中國科學C輯:生命科學.2008,38(8):699-707.?Science?in?China?Series?C:Life?Science.2008,51(9):779-788.?分子細胞生物學報.2008.41(6):?450-457.?分子細胞生物學報.2008,41(6):457-464.?解剖學報.2009,?40(2):55-58.?中國獸醫學報.2009,?29(2):191-195.）報道Ⅳ型膠原酶消化人胎兒胰腺組織，收集單個細胞和細胞團，低糖DMEM培養液培養。當原代上皮樣胰腺干細胞長出后，0.25%胰蛋白酶消化液消化，傳代。克隆環篩選出單克隆人胰腺干細胞，培養液中添加10ng/mLEGF擴增培養，建立人胎兒胰腺干細胞系。免疫化學反應和RT-PCR檢測該干細胞表達Pdx1、glucagon、nestin及CK19蛋白，不表達insulin、CD34、CD44及CD45。β-巰基乙醇誘導，分化形成神經細胞，表達NF蛋白。煙酰胺誘導，分化形成DTZ染色陽性，分泌insulin和C肽的功能性類胰島。將誘導類胰島移植在STZ制備的糖尿病大鼠腎囊內，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長壽命。閻志風等（中國組織工程研究與臨床.2008,12(3):?485-489.）無菌取人胎兒胰腺組織，Ⅴ型膠原酶消化，分離得到胰島樣細胞團。挑出懸浮胰島樣細胞團貼壁培養，上皮樣干細胞克隆性生長至單層，傳代。生長曲線顯示人胎兒胰島上皮樣干細胞傳代第3d進入對數生長期，第6d進入平臺期，細胞生長曲線呈”S”形。熒光免疫反應檢測原代上皮樣干細胞表達PCNA、Pdx1、nestin、CK19、insulin、glucagon和CD29，傳代后，干細胞則不表達insulin、glucagon和CD29。白日星等（中國普通外科雜志.2004,13(10):746-749）膠原酶消化新生大鼠胰腺組織，組織碎片采用無血清RPMI1640培養液培養。培養36h，nestin⁺細胞貼壁生長。添加bFGF、EGF、N₂，nestin⁺細胞快速增長。培養18～24d，nestin⁺細胞分化形成類胰島樣細胞團，胰島素釋放實驗檢測，分泌insulin。馮若鵬等（中國農業科學.2007,(3).582-587.?農業生物技術學報,?2011.19(1):?9-17.）膠原酶消化胎豬胰腺組織分離獲得胰島，貼壁培養，胰島干細胞快速增殖，傳18代，建系。免疫化學反應顯示胰島干細胞表達CK19和α-actin，不表達nestin。無血清誘導，2w后，胰島干細胞分化形成DTZ染色陽性的胰島樣細胞團，表達insulin和Glut2等胰島素分泌細胞功能相關的蛋白。葡萄糖刺激，分泌insulin和C-肽。將誘導細胞移植到糖尿病裸鼠腹腔內，可緩解其高血糖狀況。目前，國內尚無建立大鼠胰島上皮樣干細胞系的報道。本發明一例大鼠胰島上皮樣干細胞系及其特征，將為研究人類和其它哺乳動物胰島干細胞提供依據，這對于進一步研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。