[發明專利]一種發酵唾液乳酸桿菌提取膽鹽水解酶的方法

無效

• 申請號: 201410138333.0
• 申請日: 2014-04-09
• 公開（公告）號: CN103865910A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 齊宏濤
• 申請（專利權）人: 青島博之源生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12R1/225
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明公開了一項利用超聲波進行細胞破壁結合硫酸銨沉淀提取唾液乳酸桿菌中膽鹽水解酶的方法，所得BSH制品適用于在功能性乳制品中作為功能因子，開發生產新型的功能食品。

背景技術

血清中高膽固醇含量是誘發高血壓、冠心病等心血管疾病的重要因素。研究發現，不同種類的益生菌都具有降低膽固醇的作用，這種作用與其所產生的膽鹽水解酶(Bile?salt?hydrolase，BSH，EC?3·5·1·24)密切相關。

BSH酶廣泛存在于腸道微生物中，在其它環境的微生物中較少被發現。目前，很多BSHs酶已經從多種微生物中得以純化和鑒定。在被常規認作益生菌的乳酸菌、雙歧桿菌和部分腸道共生菌，如類菌體梭菌、腸球菌等細菌中都發現存在BSH活性。目前為止，尚未在生活環境缺乏膽鹽的細菌中發現具有BSH活性的菌株。除了兩株類菌體以外的BSH活性陽性細菌均為革蘭氏陽性菌。在其他所有腸道革蘭氏陰性菌中，包括大腸桿菌Escherichia?coli以及腸道沙門氏菌Salmonella?enterica等均未發現BSH活性，也沒有找到BSH同源基因。

膽鹽水解酶是由BSH基因編碼的一種胞內酶，是腸道微生物為了抵抗膽鹽得以生存而產生的一種代謝產物，該酶能夠水解腸道內的結合膽鹽形成氨基酸和游離膽汁酸，經BSH酶作用后產生的去結合型膽鹽比結合型膽鹽重吸收效率低，導致大量的去結合型膽鹽從糞便中排出，而膽固醇的主要去路是轉變成膽酸，因此通過膽鹽水解酶的水解作用可以使膽固醇不斷向合成結合膽鹽的方向進行以保證腸道內結合膽鹽與脂質物質的平衡，從而消耗體內更多的膽固醇，達到降低血清膽固醇的目的。

雖然目前BSH酶對宿主細胞的作用沒有公認的結論，也存在各種假說，如降低膽固醇，減弱脂肪酸和甘油一酯酸的吸收等等。但國內外大量臨床實驗證實，服用益生菌及其相關制品具有減少人體血清膽固醇含量，降低心血管疾病發病率的功效，這與益生菌產生的膽鹽水解酶BSH可能存在密切的聯系。正常人膽汁中的膽汁酸按結構可分為兩大類：一類為游離型膽汁酸，包括膽酸、脫氧膽酸、鵝去氧膽酸和少量的石膽酸；另一類為結合型膽汁酸，主要包括甘氨膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺膽酸及牛磺鵝去氧膽酸等。根據資料顯示，人體內六種主要的結合膽鹽和三種膽酸分別參與了不同的代謝活動，通過激活不同的信號傳導途徑，可以分別起到調節體內能量代謝平衡、控制肥胖的作用以及抑制腸道細菌過度增殖等作用。其中，甘氨膽酸能夠顯著抑制IgM、IgG?的含量，并增加IL-?2及TNF-A的含量，提高CD4+/?CD8+比值，提高非特異體性免疫功能。De?Boever?等人猜測甘氨與牛磺脫氧膽酸的對膽酸的高效率解離可能是使膽汁酸的毒性降低的重要原因。甘氨鵝脫氧膽酸可誘導原代培養的大鼠肝細胞凋亡，這為臨床治療膽汁淤積性肝病提供了新的思路和理論基礎。?；蛆Z脫氧膽酸可通過減少NO、LTB4的產生，直接發揮抗炎作用。此外David?A.?Wenger等人發現牛磺鵝脫氧膽酸能夠促進乳糖苷神經酰胺β-半乳糖苷酶的活性，這對研究克拉貝氏病具有指向性意義。因此，通過膽鹽水解酶的水解作用，影響膽汁酸的組成和流量對于治療高膽固醇相關的糖尿病、肥胖癥等許多疾病，維護人類健康有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種乳酸菌膽鹽水解酶及其提取方法。

本發明所提供的乳酸菌膽鹽水解酶的提取方法是由唾液乳酸桿菌得到的膽鹽水解酶。

(1)?乳酸菌發酵液以8?000?r/min，4?°C離心8?min，收集沉淀菌泥；

(2)?用生理鹽水離心洗滌菌體沉淀2次(條件同上)；

(3)?加入0.02?mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH?6.0)至發酵液原體積，細胞懸浮液于冰浴中進行超聲波破碎15?min(功率400~450?w，工作1?s，間歇2?s)；

(4)?以10?000?r/min，4?°C離心10?min除去細胞碎片，收集含酶上清液。

(5)?上清液用70%~75%飽和濃度的硫酸按于4?°C鹽析24?h，以10?000?r/min，4?°C離心15~20?min，收集沉淀的蛋白物質；

(6)?用0.02?mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH?6.0)溶解蛋白物質，再以預處理的透析袋于4?°C透析至透析液經BaC12檢驗無沉淀為止，透析液即為膽鹽水解酶提取液。