[發明專利]一種熒光微球免疫層析試紙條的制備及定量檢測方法

在審

• 申請號: 201410136325.2
• 申請日: 2014-04-08
• 公開（公告）號: CN104977409A
• 公開（公告）日: 2015-10-14
• 發明（設計）人: 劉宏飛
• 申請（專利權）人: 劉宏飛
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物醫學檢測領域，具體是涉及一種熒光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測方法。

技術背景

在生物和醫學檢測中，經常用到免疫分析法，它包括放射免疫分析、酶聯免疫分析及免疫層析等方法。放射免疫分析和酶聯免疫分析法需要昂貴的設備、專業的操作人員和復雜的操作步驟，難以快速得到檢測結果。免疫層析法因操作簡單、快速和成本底，而常用于快速定性或半定量檢測，如鹽酸克倫特羅、乙肝表面抗原、黃曲霉毒素和促黃體激素等膠體金試紙條。目前我國艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等常見傳染性疾病的發病率不斷上升，給社會和人民生活安全造成極大隱患。而基于免疫層析技術的產品因操作簡便、快速和只需肉眼觀察或簡單儀器就能顯示結果，可作為疾病或違禁添加物檢測的初步篩選方法。因此，開發基于免疫層析技術的產品有利于緩解目前我國心血管疾病、艾滋病、乙肝、丙肝和梅毒等常見傳染性疾病發病率日益上升的情況。

免疫層析技術是出現于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異、高親和性的免疫反應。層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過酶反應或直接利用可目測的標記物(如膠體金)所看到的直觀的實驗現象(如顯色)而獲得測定結果。而游離標記物(即未與待測物結合的標記物)則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。但膠體金免疫層析技術尚存在以下不足：

(1)膠體金標記過程是靜電吸附過程，屬于物理吸附，在液相中穩定性較差，己標記上的蛋白分子容易再次脫落。

(2)只有當金顆粒達到一定量時，肉眼才能分辨出檢測條帶與背景差異，因而檢測靈敏度不高。

(3)不同的材料基質效應明顯，背景干擾非常大。

(4)膠體金免疫層析技術一般用于定性或半定量檢測。

膠體金免疫層析技術檢測靈敏度較低，在實際檢測中只能對檢測測物定性或半定量，無法準確定量。目前，己有相關專利報道了以熒光納米微粒為標記物進行免疫層析檢測，如公開號為CN1645146A的專利公開了一種用熒光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層析方法及其檢測試紙條的制備。公開號為CN1866012A的專利公開了一種定量、快速的免疫檢測方法及其專用裝置，該方法將熒光物質鰲合物Eu³⁺、sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺與有機高分子納米微粒結合，制備成熒光微粒，通過熒光檢測來進行定量。這些專利公開的方法都能提高免疫層析檢測的靈敏度，但報道的熒光納米顆粒存在一定的缺陷，如染料容易泄露、抗溶液干擾能力差等，從而應用范圍在很大程度上受到了限制。

發明內容

本發明的目的是提供一種靈敏度高、簡便和快速的熒光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測的方法。本發明使用的熒光微球不受外界環境的影響，因而熒光穩定，為通過熒光進行定量檢測提供了良好的條件。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

(1)熒光微球墊的制備：稱取0.009g過硫酸鉀，0.004g?NaHCO₃溶于7ml去離子水水中，將一定質量的熒光染料溶于2ml無水乙醇及1ml苯乙烯后，加入到水溶液中，搖勻，通氮氣5min，放入70℃恒溫水浴震搖24h后，取出，離心(10000rpm×10min)分離出的聚合物分別用乙醇、去離子水離心洗滌3次，即得到聚苯乙烯熒光微球。用制備的熒光微球來標記抗體、抗原或其它特異性結合物質，并將其噴涂在玻璃纖維膜上。

(2)硝酸纖維素膜(NC膜)的制備：將抗體、抗原或其它特異性結合物質包被到硝酸纖維素膜上制成檢測區，將另一種抗體或抗原包被到硝酸纖維素膜上制成質控區。

(3)組裝和剪切：在粘性底板上依次搭接地粘貼：濾紙、樣本墊、熒光微球墊、硝酸纖維素膜以及吸水紙，并剪切成適當寬度即成為免疫層析試紙條。

所述熒光微球直徑為30-150nm

所述活性基團為-CHO、-COOH、-OH、-NH：或-SH

所述熒光物質為有機釘化合物、異硫氰酸熒光素、異硫氰酸羅丹明、6-梭基熒光素酞胺酷、熒光烷衍生物類、1，8-蔡二酞亞胺類、香豆素類有機熒光染料或其摻雜物以及量子點