[發明專利]一種高表達脂肽類生物表面活性劑的工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201410124438.0
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN103898038B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發明（設計）人: 于慧敏;李煦;楊歡;李雪;沈忠耀
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/125;C12R1/085;C12R1/38
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

技術領域

本發明屬于生物技術和生物化工領域，具體涉及一種高表達脂肽類生物表面活性劑的工程菌及其應用。

背景技術

脂肽（lipopeptide）類生物表面活性劑是一種主要由芽孢桿菌、鏈霉菌等微生物合成的兩性物質，由親水的環狀寡肽與疏水的脂肪酸碳鏈組成。不同的芽孢桿菌菌株合成脂肽的種類也不同，根據脂肽的分子結構主要可分為表面活性素（surfactin）、芬芥素（fengycin、plipastatin）伊枯草菌素（iturin、bacillomycin、mycosubtilin）等。不同種類的脂肽的區別主要在于氨基酸組成與成環方式。例如，非極性的纈氨酸與亮氨酸，以及極性的谷氨酸與天冬氨酸組成的7肽構成了表面活性素的環狀寡肽部分；而芬芥素A則含有酪氨酸、脯氨酸、鳥氨酸等氨基酸。脂肽，尤其是表面活性素具有良好的表面活性與生物相容性，在生物防治、環境保護以及石油開采領域有著廣闊的應用前景。但由于芽孢桿菌的脂肽合成水平低，與目前使用的化學表面活性劑相比成本劣勢明顯，因此脂肽的規模化生產和廣泛應用還都沒有實現。

目前，提高微生物脂肽生產水平的方法主要是通過優化培養條件與對菌株進行誘變。在培養條件方面，王德培等對發酵培養基成分、接種量、培養溫度、通氣量等因素進行了優化，枯草芽孢桿菌CGMCC?Mo.3412抗菌脂肽的產量達到1～2g/L（CN101892176）。牟伯中等通過向培養基中添加特定種類的氨基酸，實現了枯草芽孢桿菌脂肽產量的提高（CN101775427）。Yoneda等分別以麥芽糖與黃豆粉為主要的碳氮源，培養20-90小時，使表面活性素的產量提高至50g/L（WO2002026961）。Fahim等分析了不同的發酵供氧條件對脂肽產量以及產物選擇性的影響，其結果表明，k_La在0.04～0.08s^-1時表面活性素的產量最高（2g/L），而k_La在0.01s^-1時芬芥素的產量可達最高（0.3g/L）（Bioresource?Technology,2012,126:1-6）。在菌種誘變方面，對玫瑰孢鏈霉菌ATCC31568進行紫外誘變，脂肽A21978C的產量提高了185%（CN101928677）。Carrera等使用亞硝基甲替尿烷（nitrosomethyl?urethane，NMU）對枯草芽孢桿菌ATCC21332進行化學誘變，得到的突變菌株經過40到90小時的發酵后，發酵液中表面活性素的濃度為2.0-4.0g/L（US5227294）。Liu等（Plasma?Science?and?Technology,2006,8(4):491）使用低能氮離子束注入進行了菌株誘變，突變菌株發酵液50與100倍稀釋后的表面活性分別是出發菌株的5.6倍與17.4倍。

除優化培養條件與菌株誘變外，利用基因工程手段對生產菌株進行遺傳改造從而提高脂肽產量也有部分報道。顧曉波等在枯草芽孢桿菌細胞中表達comA基因，脂肽產量提高了50%（CN1554747）。盧兆新等在ATCC9943菌株中通過質粒超量表達脂肽抗性基因yerP，表面活性素與芬芥素產量分別是出發菌株的1.6與1.8倍（CN102220367）。通過將脂肽mycosubtilin合成酶的啟動子進行替換，mycosubtilin的產量發生了8-10倍的提升（Bioresource?Technology,2013,145:264-270）。

表面活性素在枯草芽孢桿菌細胞內合成，并被分泌到細胞外。脂肽跨膜運輸載體蛋白則以主動運輸的方式將細胞內合成并積累的表面活性素轉移至細胞外。蛋白YcxA的基因ycxA在枯草芽孢桿菌基因組上位于表面活性素合成基因srfA下游，其表達產物根據二級結構預測分析為MFS家族跨膜蛋白，可能具有跨膜運輸脂肽的功能（Molecular?Microbiology,1993,8:821-831;Journal?of?Molecular?Microbiology?and?Biotechnology,2002,4:37-67）。未見有關于YcxA功能及其影響脂肽生產的研究結果。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高表達脂肽類生物表面活性劑的工程菌。

本發明的目的還在于提供上述高表達脂肽類生物表面活性劑的工程菌在制備脂肽類生物表面活性劑中的應用。

本發明的技術方案如下：

一種高表達脂肽類生物表面活性劑的工程菌，其是將脂肽載體蛋白YcxA基因轉化至原始菌株構建而成，其過表達脂肽載體蛋白YcxA。