[發明專利]一種基于納米纖維支架的人體黑素細胞的培養方法

有效

• 申請號: 201410117947.0
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103861147A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 許愛娥;王文俊;蔣森陽;尉曉冬
• 申請（專利權）人: 杭州市第三人民醫院;浙江大學
• 主分類號: A61L27/20
• 分類號: A61L27/20;A61L27/44;A61L27/36;A61L27/54;A61L27/56
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明屬生物醫學領域，尤其涉及一種基于生物材料的納米纖維支架的黑素細胞培養方法。?

發明背景

白癜風是一種獲得性皮膚色素脫失性疾病,?表現為局部或泛發性色素脫失，以形成白斑為特征，組織學及免疫細胞化學顯示其皮損表皮黑素細胞消失。白癜風在人群中發病率達到0.5-2%，白斑處因缺乏黑色素，容易被陽光灼傷甚至引發癌變，同時也會給患者帶來社交憂慮引起心理疾病。傳統的治療手段包括內服藥物、紫外線照射以及外科手術治療等。但藥物治療和紫外線照射的治愈率有限。外科手術治療方法主要包括自體表皮移植、黑素細胞懸液移植等，這些治療方法證實是有效的，但表皮移植需大面積取皮，而細胞懸液移植中細胞懸液易流失，影響療效，且不適合大面積移植。構建生物相容性支架，將黑素細胞培養在支架上形成細胞皮片達到培養和轉移一體化，能有效改善懸液移植療法的不足之處。

利用組織工程技術、通過細胞負載與轉移，為治療白癜風提供新的途徑。CN?1919352A公開了一種含殼聚糖的納米纖維組織修復支架，但支架的機械強度低。CN?1952227A公開了以一種用于仿生細胞外基質的明膠-殼聚糖纖維支架，支架浸泡后其結構易受損。CN?101445971A公開了一種仿細胞外基質的絲素蛋白-殼聚糖納米纖維支架，絲素蛋白的引入可能引發細胞的免疫性反應。CN?103194856A公開了一種具有抗菌作用的殼聚糖-絲膠納米纖維，用作傷口敷料。現有公開的納米纖維支架專利主要用于組織工程的修復，尚無用于人體黑素細胞培養的公開報道。?

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種基于納米纖維支架的黑素細胞的培養方法。?

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種基于納米纖維支架的黑素細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：?

（1）制備生物材料的納米纖維支架：將一種或兩種生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后溶解于溶劑中，配成重量百分比為1-10%的溶液，通過靜電紡絲，制備得到厚度為30-200微米的納米纖維支架，在真空、20-50oC下烘2-48小時；然后用交聯劑對納米纖維支架在20-50oC交聯處理0.5-24小時，交聯處理后用純凈水沖洗除凈殘留的交聯劑；然后用氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液浸泡24小時，再用去離子水清洗至溶液pH為中性，所述氫氧化鈉-碳酸鈉水溶液中，氫氧化鈉和碳酸鈉的總質量與水的質量配比為1-10:90-99混合組成，且氫氧化鈉與碳酸鈉的質量配比為1:3-3:1；再在鼓風條件下于30-120oC下烘2-48小時。

（2）構建細胞-納米纖維支架復合材料：納米纖維支架用于接種細胞前，用體積濃度為75%的酒精浸泡12小時，隨后再用PBS洗凈殘留酒精，并置于紫外燈下照射3-24小時。完成消毒滅菌后，在細胞培養板里注入細胞培養液，置于細胞培養箱中于37oC、體積分數為5%的CO₂、飽和濕度條件進行孵化。將按1-40:?0-200:?0-100的細胞個數比例共培養的黑素細胞、成纖維細胞和角質形成細胞以?個細胞/cm²的密度接種在孵化過的納米纖維支架上，同時加入1-10毫升的細胞培養液，置于細胞培養箱于37oC、體積分數為5%的CO₂、飽和濕度條件下培養，每兩天更換一次細胞培養液，培養時間為1-10天，即獲得細胞-納米纖維支架的復合材料。?

所述溶劑包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙醇、六氟異丙醇、二甲基亞砜等及其與二氯甲烷的混合溶劑，混合溶劑的重量比為5:1-1:1。?

所述靜電紡絲條件：電壓為5-30KV、推進速率為0.1-10ml/h、接收距離為5-30cm、溫度為10-50?oC。?

所述細胞培養液含100毫升F12培養基、0.1-100毫升FBS、10-50000納克CT、?10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分。?

本發明的有益效果是：通過對所得的生物相容性納米纖維支架材料（圖1）進行表征，具有多孔結構（圖2），適合細胞生長。同時具有良好的機械性能，在制備、負載、轉移和移植過程不發生破碎和斷裂，符合轉移和移植的要求。細胞-納米纖維支架復合材料的構建過程中，細胞在生物相容性納米纖維支架材料上的形態良好，多孔的納米纖維結構益于培養液的更新，從而促進了細胞的增殖，使細胞保持良好的活性（圖3）。?

附圖說明

圖1納米纖維支架；?

圖2納米纖維支架SEM掃描電鏡照片；